第十三章 聚合酶链式反应CR

第十三章聚合酶链式反应

(PCR)1第一节聚合酶链式反应(PCR)PCR是一种选择性扩增目的DNA(或RNA)的方法.2一、PCR的基本原理和反应过程1.PCR的基本原理原理:DNA的变性、复性、半保留复制。2.PCR的基本过程基本过程:变性、退火、延伸三个基本反应步骤3①变性:DNA高温变性，加热至90－95℃并维持一定时间，使双链DNA氢键断裂，解离成为单链，成为模板。

4②退火:变性DNA分子在温度降至适当时，重新形成双螺旋结构，该过程称为退火。在PCR过程中,当温度降至45-55℃时，单链DNA模板与人工合成的引物DNA结合.5③延伸:当PCR温度升至70-75℃度时，在加入的DNA聚合酶的催化作用下，体系中的4种游离的dNTP遵循碱基互补原则，按引物5'→3'方向合成模板DNA新的互补链。6高温变性低温复性适温延伸95℃55℃72℃78整个PCR过程一般需要30次循环，从理论上讲能将目的DNA扩增230倍，约为109倍.PCR的平均扩增效率约为75%～85％，完成一次循环需2-3分钟，经过n次循环后扩增的倍数约为(1+75%)n。2-3小时就能将目的DNA扩增几百万倍。9二、PC亏R的特杨点⒈特异絮性强问扩增亮的目只的DN迈A，可失以是DN烘A混合窗物中肃的某宁个特胁定分斑子，佣也可游以是DN塘A大分宿子的梨某段恰特定品序列10⒉灵敏坑度高皮应用PC隆R技术件可以宅对一纲根毛守发、担一滴沿血、北甚至霞一个种细胞盟中得反到的DN赵A片段诊进行原扩增需、分诱析和陡鉴定程。在气病毒漆学检之测中吵，PC厘R的灵样敏度桃可达3个RF通U(空斑歉形成代单位)；在搂细菌烦学检愧测中鞠，PC庙R的最帅小检坐出率克为3个细考菌。11⒊简便戏快捷PC科R技术卵使用剂的是州耐高膀温的Ta郑qDN煌A聚合怀酶，牙且已受有各告种PC锡R扩增桃仪供包应。夏只需搅将反李应液报一次浓性地幼加好凉，然逆后设裁置一婶定程过序，嫩即可勾在DN讲A扩增册仪中桥进行变性-退火-延伸反应盏，一戚般在2-姥4小时议就能席完成12⒋对样贺品要缸求低奶病毒蹄细章菌泽培养涂细胞仍，其DN遣A或RN购A粗制酷品均单可作握为扩赢增模洪板。醉扩增葱样品嘉可以宴是新蒸鲜的讽，也重可以叫是陈杂旧的否；可绢直接李用临障床标雄本进渐行扩丧增，循如血佳液、莲体腔飞液、途洗嗽违液、俘毛发勤、细壳胞、岔活组挺织等台。13三、PC涨R的体议系组馅成和扮反应队条件（一捏）体贴系组臣成:模板铅（目呢的DN峡A(盘RN灶A)）耐热DN迟A聚合既酶寡核灾苷酸僵引物原料:dN汇TP缓冲背液和Mg文Cl2反应调体积千一般暂选用50进-1友00宝μl141.引物:决定PC很R的特轧异性PC厕R产物伪的特墨异性异取决奴于引千物与弯模板DN蛙A结合云的特姨异性组。故伙引物核设计笛在PC退R技术芒中十肠分重低要。PC晓R扩增暮的是狭一个勒双链作目的DN瞎A，所喷以需设要两违条引隶物，闲分别拥与目每的DN柏A的两途股链衣的3’端互依补。引物骗合成灯方法:化学颤的方窄法合毅成，原则倦如下陈：15⒈引物楼长度隆合适:不少惰于15个核额苷酸跑，一密般为15－30个核与苷酸⒉引物舱碱基握组成碑与分胖布随爪机:种AT蛇CG随机判分布,避免5个以生上嘌钟呤或烤嘧啶匪串联趴排列,C机+G含量托以40战%-海60修%为宜16⒊两竖条引酷物的塞碱基勾组成角一致:碱基护组成委影响翁退火食温度其，两肉条引部物的施碱基坛组成尿一致陆，可捆以确咳保适震用相践同的唯退火辉温度⒋引恳物内盾部避苗免出霞现二谣级结据构:引物话自身状互补昏序列遗不能爽超过3b恭p，以吸防止骆形成悄茎环钩结构17⒌引物串之间装不应类互补:特别乐是3’端的溪互补竿，否期则会股形成贩引物槐二聚思体⒍引物3’端喉碱基洲要求浅严格班配对:特别圈是最损末及摔倒数供第二氧个碱乎基,以避翼免因朽末端永碱基妨不配植对而痰导致PC纽奉R失败18⒎引娱物的5’端可屈以修滚饰:引物5’端不领互补劫不影醉响PC理R，可针以修辨饰，俗包括比加接插限制欢酶识或别序晓列或京密码煎子序灿列，泄引入极突变浩位点缸或末绍端标太记⒏引枪物应晒严格俱特异:为防保止非自特异旨性扩岂增，毫引物删与样验品中桐的其词他序列列应订无明勾显同苹源性脂，一进般同削源性投不超滚过70午%。19⒐引物顽量合她适双在PC端R体系还中，赴每条朱引物嘉的浓因度应盾为0.稍1-茎1μ潜mo格l或10齐-1懂00浴pm为ol。引抱物浓略度过迁高会葱引起讲错配面和增网加引包物之建间形赏成二逐聚体透的机秆会，湿发生捉非特桥异性宗扩增采。⒑引物易质量柱好:需要亩纯化拦，聚分丙烯勿酰胺档凝胶座电泳淘法或秃反向暴高压威液向俊层析割法。20㈡酶及姨其浓饼度Ta填qDN指A聚合柔酶是从火水生居栖热托菌(Th吉er临mu诱saq妖ua继ti维cu蛛s，Ta架q)分离众出来璃的，街故Ta晴qDN待A聚合香酶有铺良好舞的热牙稳定笛性，暮在92并.5蚂℃、95纱℃和97正.5窃℃下的场半衰灯期分栋别为13静0、40和5－6分钟除。其浮催化DN叶A合成泳的活网性可困适应杂相当缩慧宽的零温度带范围咐，但境在75塌℃－80逼℃活性萌最高构，降赔低温宋度则慢扩增进效率资随之樱降低病。21特点：①以DN婚A为模拿板，dN娱TP为底核物，尿与目伟的DN米A结合妨的引阳物的3’端为吃起点攀，遵争循碱盖基互讽补原屿则，睬按5’泪→3'的方瞒向合萌成DN瞒A新链胞。②有5'怖→3圾'外切戴酶的茫活性械，但妹无3'画→5炭'外切健酶的交活性谅，所兰以没赶有校润对功孔能，凡其错鉴误率红为0.森25节%，即善扩增亭产物敢中每40假0个碱团基可蓬能出叮现一稿个错威误掺什入的给碱基惠。22③具毯有反漏转录研酶活碌性，认可直敏接用祸于从RN员A扩增cD赚NA，使RT惧-P液CR技术雄简化撤，但命该活膏性依毁赖Mg2+或Mn2+。④具左有类衰似末蚁端转览移酶硬的活竖性，雾可在迎新合顷成链管的3'端加沙上一富个不慕依赖烈模板搂的核延苷酸储，而椅且优裳先加封接dA维TP，利优用这合一性竞质可兽以构紧建载劫体,克隆机带dA厦TP尾的PC兵R产物递。23浓度益：催化爱一典绞型的PC诉R所需疤酶量乡丰约为2.榆5U驰(指总旺反应路体积忽为10句0μ吊l时)，浓是度过帅高可父发生甘非特墓异性核扩增悠，浓坊度过弟低则蠢降低游扩增屿效率妖。24㈢dN垃TPdN岭TP是PC蒜R的底脱物，缠其浓叼度、蝴比例闭和质齐量与集反应关密切详相关痕：浓滴度应膀根据乓靶序蠢列的帜长度优和组施成确缺定，禁一般坐在20傅-2佛00资μm便ol调/L之间慈，并笼且4种dN智TP的摩箭尔浓用度要弃相等掌。过高穴反殖应速牵度饶碱基盒错配相率过低罚反贞应的露准确堡性粒扩衣增效鸡率25㈣待扩梢增样壁品PC嘴R的样妹品可奸以是DN导A或RN绘A如为RN轿A时，据应先扰逆转肺录生秤成cD欧NA，然夸后再宾进行讲正常活的PC绸R循环病原名体标召本：拴如病仅毒、也细菌蚂、真太菌、天支原骗体、盆衣原狼体、壮立克蔑次氏杏体等临床部标本茄：如沙细胞苍、血尊液、拦尿液梢、分贷泌物右、羊猫水等法医笑学标晋本：货犯罪叉现场打的血外迹、根精斑职、毛概发等考古框标本根：26㈤Mg2+浓度Mg2+可以航影响骨解链俊温度城、退渐火温陆度、珠影响得酶活武性、美产物剪的特负异性付、引降物二磁聚体罚的形装成等一般斜在0.宫2－2.秀5m绢mo遵l/声L之间挨，常见用1.详5m屋mo拆l/齐L。27组成量10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物各200μmol/L引物各10-100pmol模板DNA0.1-2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L加双或三蒸水至100μlPC贱R体系栋组成28（二烦）反诵应条福件1.反应曲温度袭与时起间①变性迫温度滨与时天间：95班℃、30秒钟顶或97狮℃、15秒钟巡寿（拿第一辱次变围性5～7分钟饭）②退火奴温度乐与时喇间：45阵℃－55抢℃，30－60秒钟③延伸锡温度振与时翼间：70－75惯℃，30－60秒钟陕（最昂后一地次延咽伸延捷长5分钟裤）29Ta轧qDN翻A聚合否酶的快活性域受温币度影破响：踪蝶在70－80托℃时，讯每个型酶分焰子每甩秒钟筑可催板化延形伸约15条0个核迷苷酸滥，在70坚℃时为60个核摄苷酸涂，在55努℃时为24个核办苷酸鸽，高信于90皂℃时几肢乎完队全失虾活。30PC完R的延岩伸时饱间可船以根表据目蛙的DN痒A的长义度确蓬定：1k津b以内栋一般将延伸1分钟大，3－4k子b需延暂伸3－4分钟颜，10筹kb需延蛮伸15分钟驰。延捉伸时徒间过廊长会面降低宰扩增例特异析性。孤如果拘模板滨浓度暂太低斧，延灿伸时闷间要毛稍长饰些。312.缓冲飞液：询提供PC腔R反应右合适垮的酸维碱度艺和某胁些离扮子（玻主要眉是Mg2+）。剃常用10－50政mm债ol莲/LTr件is遥-H萝Cl(2良0℃时，pH附=8勿.3－8.惭8，72瞎℃时pH弹=7呢.2录)缓冲悟液。323.循环愁次数PC胳R循环屑次数赢的设邀定主丢要取夫决于余初始铺目的DN云A的浓迈度。本一般散的循穿环次灯数选妙在30－40次之财间。酒循环朽次数盗太少感，产螺物的桃量不票够多游；循刮环次像数越规多，隐由于括各种医原因焰越容趟易发若生错炉误掺肯入，猛从而诱降低陆扩增球特异枕性。33原则勺是：壳在满驾足产铁量的欲前提图下，望应尽习量减牙少循啊环次永数。弊如果烧产量俱不够锈，可敞将产守物适谋当稀丝式释，从再继窄续扩脸增。34四、PC柿R扩增基产物挽的分方析㈠凝胶亲电泳音分析凝胶旨电泳括可帮祸助判劳断扩脊增产缘瑞物的红大小潮、检眉测扩就增情耀况，搂从而值对扩烧增产都物进眠行鉴持定3536㈡酶活切分跃析根据PC税R产物手中存因在的港限制晃性内备切酶抚的识恼别位牌点，繁用相懒应的茅限制盛性内馒切酶形切割职，电哀泳分坟析酶驴切片普段，轻对产但物进印行鉴也定，佣靶基粮因分喊型，惊还能雾进行恼变异匪性研叨究。37㈢分子撞杂交分子暮杂交熊是即掏可检料测PC畏R产物蜻的特阁异性合，也聪可检傻测PC棵R产物枪的碱颈基突贿变。出包括So变ut散he鹿rn印迹谢法，珠斑点其杂交参，微增孔板民杂交歼法等38㈣DN遥A测序测序娘是检守测PC弓R产物绣特异薯性的繁最可尊靠方揭法。俩能对鸣靶基侨因分老型，诵还能准进行倘变异展性研昨究。39第二厦节PC彻R技术赵的发荐展⒈逆转掏录PC女R逆转跪录PC盆R(锦RT档-P列CR古)是以mR程NA为模码板，揉由逆喝转录竟酶催铜化合cD纷NA，将cD肢NA通过PC辅R扩增匙，扩闸增产搞物再滩走凝渔胶电踢泳，炉通过屋分析瘦电泳听图谱罚可以刑鉴定cD百NA的长炸度，cD填NA的长越度即汗为mR贫NA的长两度，糕进而捕推断熄是否璃存在保基因壤缺失亮或插沫入，温以及mR枣NA加工慈过程舌是否晓异常悉。40如果挤对电赶泳图浮谱进婶行光烘密度决扫描选，还多可以欢计算银出相蜻应的mR证NA量。RT础-P腔CR使微强量mR灵NA的信威息迅年速扩蹈增，缘瑞大大称提高吵了mR跃NA检测咱的灵伪敏度浆。41⒉定量PC佳R应用狠定量PC挠R技术酸可以歇定量的检测稼样品尺中目路的DN轮A的拷轮贝数喜。通夸过测么定PC丹R扩增奋产物结的量预推测扣出原亲始样奥品中蚕目的DN孕A的拷挨贝数更。42必须珍设立革内参肆照。古具体颗的方刑法是滨，将扯目的DN猾A和一芒个单钓拷贝并对照DN奇A放在盒同一典试管斩中进五行PC赢R扩增梅；然层后将洽扩增卖产物确走电孝泳，咏使扩居增的升目的DN宅A和对漆照DN口A分离荡，呈煮现两阶条区赶带；葱通过爹比较兴两区霞带的叼度，屋或测耻定两世区带经的放轰射性经强度偷，即解可推西算出揪目的DN醋A的拷株贝数毛。43定量PC匹R技术特：竞带争定腰量PC转R实时掌荧光续定量PC租R定量PC全R技术期与逆诞转录呀结合无，可翠以检测mR徐NA的绝圣对含疤量。4445⒊多重PC颈R被检距基因计太长(2镜kb以上)存在体多个渗位置枯的缺梦失和锅突变方法克：用多对引物泼同时元扩增址一份DN您A样品堂的不灭同序雀列区雁域，掉每对总引物驰所扩鉴增产虎物长维度不量同，防根据饱电泳轻结果译判断圈是否锋存在咽某些析基因宣片段昆得缺恰失或巡寿长度渗改变蒙。这书样一揪次反茎应就棕可以膊检测蛋多个胞变异形位点肠。46⒋重组PC摩R研究糠基因耻结构糠与功板能的宝关系篇，常桑需要塌突变漂基因增结构保，如蜜碱基给替代浆、缺妈失或科插入弦等，停以观爽察基板因功勉能的贺改变究。通常贯的方泛法是避用合辆成带丙突变挣的引袍物，轻复制降完整再的突互变基昼因。PC肺R能使偷体外堵定点挑突变恐简便息快捷峡，PC油R参与掉的体搏外基续因突仆变过训程称痰为重氧组PC维R，。47⒌不对子称PC泻R典型哪的PC批R扩增遮产物屋是特污异的袜双链DN包A分子奔。如态在反直应体畅系中惭加入馅不同莲浓度帽（两伞条引适物的断浓度摩比一名般为50－10史0:靠1）的迎两条携引物拣即可使获得梳特定糟的单恶链DN愁A，称享为不剩对称PC侍R。DN再A测序合及基形因诊毙断中博常常督需要壤大量胖单链DN陶A48⒍原位PC壳R将组赞织或度细胞势经过跟固定在处理谷，使询细胞赤膜具召有一雾定的鼓通性疾，然价后在富细胞酱内建浑立PC奖R体系僻，扩把增细妄胞内换的DN舰A或RN