第十二章 高效液相色谱

第十二章

高效液相色谱

(HPLC)概述

高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:>20h经典柱色谱HPLCt分离：1h经典液相色谱法高效液相色谱法（分析型）固定相一般规格特殊规格固定相粒度（μm）75~5003~20固定相粒度分布(RSD)20~30%<5%柱长（cm）10~10010~30柱内径（cm）2~50.1~0.5柱入口压强（kg/cm2）0.01~120~300柱效(每米理论塔片数)10~100104~105样品用量（g）1~1010-7~10-2分析所需时间（h）1~200.05~0.5装置非仪器化仪器化高效液相色谱法与经典液相色谱法气相色谱（GC）

高效液相色谱（HPLC）

应用范围

占有机物的20%占有机物的80%分离效果

高

更高

选

择

性流动相是气体，只能选择固定相

流动相是液体，流动相、固定相都可选择。选择性广。

温

度

高温

常温（分离效果好）

灵敏度(g/ml)10-12

10-9

液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较

（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。

液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。③液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。 但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。目前掌高效烧液相趋色谱铃法已应被广辅泛应净用于太分析郊对生漠物学经和医陡药上牛有重送大意刑义的乞大分鹿子物言质，复例如尊蛋白身质、烦核酸胳、氨拔基酸里、多鸽糖类脊、植碎物色爬素、殿高聚主物、煮染料爹及药托物等泛物质佣的分刑离和述分析协。高效白液相次色谱圈法特灯点①适医用范腰围广夫；②分制离性问能好昨；③分葱析速淡度快吉；④流回动相筹可选多择性遮范围迹宽；⑤灵拾敏度理较高带；⑥色秆谱柱巷可反胀复使颂用；⑦流足出组拒分容正易收裹集；⑧安绢全。高速高效高灵蚀敏度类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析液相臂色谱盗的分词类应用由于HP它LC分离版分析熄的高旨灵敏够度、腥定量这的准捏确性采、适磨于非赔挥发告性和历热不射稳定友组分不的分均析，初因此弹，在崖工业抽、科障学研沿究，砖尤其既是在伙生物共学和浑医学欲等方革面应闸用极射为广凯泛。珍如氨率基酸座、蛋世白质进、核愉酸、俩烃、脱碳水立化合挥物、碧药品打、多击糖、安高聚平物、唐农药目、抗坦生素割、胆最固醇滋、金光属有时机物僻等分贵析，躬大多盏是通搭过HP姓LC来完将成的纹。右图饶是各拼种HP智LC方法土的应塘用范黎围及港对象极性饺增加不溶旧于水溶于聪水非极轨性离子非离音子极植性吸附反向怀分配分配正向洁分配离子熟交换尺寸锈排阻凝胶盗渗透凝胶赠过滤分子量第一睁节液相松色谱蔽柱效一煎液相关色谱泼速率加理论可忽略Ⅰ涡流扩散项Ⅱ流动相传质阻力Ⅲ分子扩散项Ⅳ固定相传质阻力项Ⅵ流动相传质阻力流动舟相流炮速对顶板高毙的影阿响小颗逮粒填蹦料，康填充誉均匀捎；选择较较低拔的流险动相赵流速菌；选择惭粘度摆小的搅溶剂队作流抓动相糟，改愈善传保质。修正跟的速储率方叛程：提高蜓柱效石途径二朋液相忧色谱羞中的方柱外碰谱带秆展宽柱外伴谱带劲展宽司又称洪“柱是外效介应”即，系烂指从香进样隆点到宽检测舞池之拌间除橡柱子躲本身嚷以外闲的所玻有死码体积申所引延起的第色谱喷峰展盘宽，忧柱效揪下降。可分横为：柱前脏展宽主要泰由进双样引险起，窗减小净进样孙器的码死体殿积，盾用阀单门进坝样可惊减少异柱前蒙谱带船展宽赴，提闪高柱壮效。可分寒为：柱后纷展宽主要谢由接苹管、项检测行器流色通池膜体积酿及检鞋测器阀响应驶时间命等因硬素所砌引起乞。因裹此，销尽可乏能用吊短而赚内径弄细的掘接管胁，减绵少流钟通池返体积存，改暖进检水测器教和记孩录系葡统的督响应傲速度败等都冲是克射服柱点后展买宽的毙途径第二四节童高效液相途色谱临仪一、炕高效感液相环色谱衔仪流筹程图1．贮仪液罐(滤棒例，可汤滤去贩颗粒稿状物视质)2．高教压泵劈燕（输混液泵播）3．进侨样装炉置4．色寇谱柱——分离5．检园测器——分析6．废碌液出怨口或爷组分林收集丘器7．记阴录装秘置高压惩泵流动必相溶纳剂废液色谱艺柱进样陈口检测教器高效漆液相弟色谱密仪流万程图一泛高压势输液挪系统要求输出双压力破高平稳亡、脉饥冲小流量舱稳定妻可调耐腐棋蚀注射让泵1高压泵

恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关，如往复式柱塞泵、注射式螺旋泵；

恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，如气动泵。往复蛮式柱乡丰塞泵注射医式螺极旋泵驳；2梯度摊洗脱节装置通过坝改变萌流动梯相的乞组成价来调访整组贫分的k值，辞改变牛分离姐因子α值，搜以达搬到最横短时蚂间内接得到们最佳禽分离裤的目俗的。梯度俭洗脱适合转于二暑元梯扯度适合纸于多懂元梯凑度等度语洗脱旱与梯德度洗滑脱梯度药洗脱润的特蚀点改善泛分离厚,湾加快闸分析逼速度恰；改善爱峰形奴,骡减少稀拖尾铲;可能刚引起基线外漂移分配刮比变傻化范铸围宽误的复杂来样品春应采横取梯度部洗脱你方式叉分离3贮液者瓶及夺流动阁相1)冤对扭样品旅有一百定的办溶解绒度，穗以防浮在柱求头产脸生沉散淀。2)岛适喉用于驶所选刮择的挪检测贯器。3)拥化脏学惰早性好膀，以历免破钩坏固拒定相役。4)务低跌粘度像，增离加样殊品的答扩散赠系数丘，提洽高柱樱效。5)拍纯院度高鸽。溶对剂不响纯会魄增加职检测拘器噪舱声，滥产生逐伪峰布。对流俘动相贡溶剂育的一甚般要名求二进样添系统取样哈和进丢样功爱能手动废和自犁动要求奖：密封臣性好死体妈积小重复福性好进样振时对晨色谱馅系统援的压其力和天流量敌波动使小二进样针系统

准备状态进样状态六通渗阀进相样装置自动爪进样户器三色谱万柱内径唇：4～懂5mm，柱长摔：10勤～5奇0cm午；柱填朴料粒衫径3～10µm分离冤柱干法填料痒粒度测＞2控0µm时湿法颗粒点＜2猎0µm时色谱魄柱的乞填充匀浆杠法装川柱示潜意图四检测骗系统溶质予型检测佩器总体检测贵器示差折光检测器介电常数检测器紫外检测器荧光检测器电化学检测器1紫外肚吸收缘瑞检测充器(a)可变善波长建紫外带检测泥器(b)二极劳管阵粱列检使测器氘灯光栅流通懂池测量柔光电己二极膀管参比心光电别二极匪管2角二极驶管阵燥列检剪测器两种从检测阵器的灯色谱有图(a)抄：可变匀波长旺紫外姐检测削器；(b)日：二极盈管阵桂列检澡测器(b)(a)紫外沾检测包器灵敏痛度高鸟，精密对度及抗线性寒范围游较好丛，叙可用维于梯旁度洗乐脱。颈流偏动相抬选择铺有限嘉制。一些载常用巾溶剂驱的紫标外截政止波冠长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长/nm3802452122101902051873荧光织检测兽器灵敏廉度高护，选蒙择性盏好，饰可用它于梯她度洗街脱。4示差炮折光隙检测贤器利用崇组分侮与流润动相岭的折赵射率股之差改进行贫检测溜。通用访性好赢，灵弦敏度躺较低损，不糖适用捕于梯泽度洗耐脱。5洞化学功发光蓬检测味器6电化阶学检垄测器电导欧检测啊器安培谅检测尊器7质谱墓检测饿器五检测敌系统脱气头装置筝梯度竹洗脱陵再容循环药恒情温汉馏分铸收集谎及处移理第三怖节筑分配喜色谱分离摘原理K不仅烤与固衬定相越的种陈类有权关，淘也与杯流动惩相的各种类辅有关液液徐分配挣色谱液液饥色谱键和拣相色都谱通过踏物理网吸附揪的方深法将店液相洽固定话液涂献在载释体的哀表面通过急化学灿键合眉方法载将液排相固榜定液牺涂在朽载体害的表毁面固定币相非脸常稳末定，榜在使缎用中纸不易杏流失测。由鸦于可让将各昏种极顾性的素官能庙团键伙合到网载体视表面治，因逗此它阿适用袜于种忙类繁晴多样浪品的穿分离既。缺点特点固定液溶液流失一、交化学涝键合删固定泰相化学漆键合倦固定熊相:申目唇前应麻用最粉广、冻性能瓦最佳叹的固费定相锡；硅胶为基策体，利用秩硅胶歇表面永的硅屈醇基缸(Si一OH敏)与有廊机分称子之降间成与键,沫即可窄得到宴各种挎性能上的固镰定相雁。一逆般可趁分三镇类（1典）疏水液基团如不赵同链议长的轮烷烃往（C8和C18）和苯府基等士；（2幸）极性晌基团如氨飘丙基岛，氰浩乙基股、醚苹和醇斩等；（3临）离子倚交换波基团如阴园离子积交换摊基团螺：胺佳基，杀季铵狐盐；份阳离陡子交叮换基刷团：廉磺酸粪等。键和类型键合携方法（l）硅酸脆酯型管（≡Si一OR揭）键合炮相，适用遇于不苍含水腔或醇祸的流胀动相匆；（2）硅轨氮型觉（畅≡Si一N=）键太合相站，可用钱于非沾极性戏或强外极性课的溶星剂作脑流动镇相，亚当使真用水瞒溶液多时，逮必须倍限制pH在4限8范围惜内；（3）硅娇碳型丢（≡Si一C≡）键合导相，丽同硅经氮型孩；（4）硅怜氧烷逝型（≡Si一O一Si一C≡）键合还相，具有宵热稳肤定性绿好，投不易跨吸水还，耐珍有机母溶剂萍，能延在70夸C以下王，pH在2睛8范围鲜内正鼠常工谢作。2.窜键斗合相豆色谱看法分恒类反相京键合婆相色幻玉谱:常用杏固定借相：C18分离垫对象非极匪性中等锣极性桶化合掩物常用浊流动本相甲醇等-水乙腈涂-水反相挡键合赖相色伶谱疏溶援剂分掩离机嚼制固定粥相极叨性<百流动弃相极吐性正相情键合孙相色撤谱固定捏相极继性窑>坟流动苏相极爆性离子俱性键糟合相窗色谱将各营种离尘子交掘换基某团化帽学键典合到另硅胶千基质赔表面谋上，蹄就形尤成了匪离子衬性键押合相祝色谱朽的固干定相悠。其迫分离逼原理植与离篇子交油换色邻谱类饥同。3.丝式化学暂键合庸固定跃相的辰特点（1班）传质需快（2们）寿命磁长（4瓶）选择剩性好（5淘）有利阿于梯嫁度洗豪脱；存在颠着双重预分离六机制：(键大合基能团的徐覆盖馒率决挺定分收离机翻理)高覆秋盖率抛：分锣配为店主；低覆叉盖率补：吸膀附为撑主；二、聪固定尚相流肢动相散的选摧择第二馋，流颂动相傲的极策性与套分析泳物质键的极问性相互匹配乌，用极性牵明显葡不同型固定苗相。第三扭，固浴定相爽的极魂性与狼分析击物质孕的极拜性相铃匹配运，仅有买流动疑相的盐差异宅使分惜析物穴质沿钱柱移满动。柱子损的选翁择第一，固定相的极性与分析物质的极性粗配，用极性明显不同的流动相洗脱。反相毫键合盈相色障谱:常用烤流动冰相甲醇贼-水乙睛霸-水分离题对象非极疾性中等编极性肾化合缓物通过核调节缓水的遮含量继，可使山保留桥因子k迅速拉变化通过脚改变睛流动缝相的边化学翠性质年，可使够选择倍因子α迅速辽变化反相编色谱暗四溶企剂系蒙统甲醇易、乙趁腈、伏四氢忆呋喃陡、水正相摊色谱菠四溶某剂系划统乙醚产、氯某仿、局三氯泳甲烷怖、正狼己烷调节k调节α三、缓洗脱北物的起流出邻顺序反相躁键合塌相色蛮谱:极性尖大的奖先流铺出，毯极性遇小的笨后流剂出正相拴键合氏相色裁谱:极性阿小的艘先流樱出，朱极性陕大的饥后流陶出四、衬分配皇色谱闷的应酿用通过堤改变能流动哪相的帽组成惊，容忙易调霜节kα反相键和相色谱的优点用单此柱和代流动进相就谷能分抽离非报离子惭化合维物、离子裙化合易物、简可电存离化其合物用便雾宜的丧水作谣为流之动相受的主押体，嘉以价仇格适齐宜且易倾纯化棒的甲无醇为就有机队改性饲剂可以府预言颠洗脱渗顺序色谱乓柱平墙衡快转，适浊宜梯严度洗俩脱反相岛色谱节法是费应用旱最广淡的色这谱法桑，主甘要用罩于分详离非幸极性圾至中束等极哨性的顷各类脑分子优型化情合物戴，因楼为键修合相报表面券的官菊能团煌不流协失，创溶剂箱的极壤性可鸭以在绸很大贞范围厉内调巷整，锦因此窗应用晶范围灾很宽骂。由扮它派摸生的沿反相旅离子漂对色怎谱法在与离毁子抑季制色铲谱法妖，可晨以分捉离有图机酸固、碱玩、盐风等离课子型塘化合枣物。用反愁相液若相色痰谱法聚，可泄以解宴决8睡0%寄左右孝的液次相色煎谱课探题。因此衡，必焦须给新予反兽相色药谱法斑足够嗓的重热视。嗽对于煤结构端异构冒体等削难分岗离物历质的随分离筹，则更应选伤用吸降附色任谱法择。具体员看表喷21涛-3第四么节课液固逮吸附寨色谱一宴吸附芳色谱槽法1分离费原理Kad值越趋大，晋保留恋时间躬越长滋。2固定穿相硅胶－强极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性分子筛－强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂3流动东相(洗脱穷剂)越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。溶剂铲分子馋在单成位吸钻附剂状表面纠上的胁吸附锁自由县能溶剂决强度购参数硅胶聋固定播相分公离苯怪，甲垒苯，牲乙苯筋，丙尝苯，换丁苯流动倘相：干燥刺正庚裂烷1份穴水饱建和的喝正庚片烷2份缘瑞干燥笨正庚搅烷水饱帝和的懒正庚券烷改变恶流动慨相的组成植可改都变分范离的选陷择性4应用具有不同踩官能啦团的氧化合伯物具有膊相同松官能妇团，蜓但数即量不碌同的没化合董物异构淹体例：肉几种粒取代业位置娘不同刺的硝纯基苯仰胺的拴分离晓。在昏硅胶秒吸附柜剂上抬的滞献留顺季序：邻位<间财位<货对位邻硝基苯胺间硝基苯胺对硝基苯胺适合锹分离管的物起质第五佣节个其他洞色谱奸分析一天离子备交换殊色谱坑法阳离谈子交板换树生脂阳离宰子交你换阴离接子交印换1分离亭原理2固定碌相阳离扬子：－SO3H(强)－CO2H(弱)阴离暖子