分子病理技术-课件

分子病理技术

一、概论

二、免疫组化

三、原位杂交

四、原位PCR（在实验细胞学中讲述）

五、原位末端标记技术

（在细胞凋亡检测方法中讲）

六、组织芯片技术（李杨）

七、纳米技术（原子力显微镜）1分子病理技术ppt课件复习题1什么是分子病理学？常用分子病理技术有哪些？2什么是免疫组织化学？试述免疫酶组织化学的方法和原理。2分子病理技术ppt课件

一、概论

生物高新技术——病理学中的应用

向二方面发展：

计算机和图像分析技术的应用

简单的形态描述——量化方面发展

直接观察——远程远输“间接”观察

定量病理学和远程病理学

原位杂交、原位PCR和原位末端标记技术

分子病理学水平

近些年来，尤其是纳米技术的诞生

使人们对疾病的认识达原子水平3分子病理技术ppt课件分子病理学

从分子水平研究患病机体生命现象的科学

从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机制的科学

分子生物学

细胞生物学互相渗透、交叉

经典病理学

分子病理学的形成是分子生物学技术在病理学中的应用的具体体现。4分子病理技术ppt课件

技术手段

（1）分子免疫学+病理学乃至形态科学-—

免疫组织化学

（2）分子生物学技术

（探针；PCR；分子杂交）+形态学科

ISH、ISPCR和原位末端标记技术

(3)生物芯片技术—组织芯片技术

(4)纳米技术—对疾病的认识达原子水平5分子病理技术ppt课件

研究内容--阐明疾病的病理机理

（1）“大海捞针”式探讨单个致病基因与疾病关系研究—人类基因组计划

（2）信号转导—疾病关系

认清疾病发生的信号转导机制

最终阐明其机制

寻求干预和防治疾病

6分子病理技术ppt课件

病理学发展以方法为先导

人类科学进步的历史和学科的发展——

以研究方法与工具创新为先导

一项新技术的创立，随之带来一批新的研究成果

在病理学领域中

系统解剖—LM—EM—免疫组化技术

器官病理学—细胞病理学—免疫病理学7分子病理技术ppt课件原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的学科推进到分子病理学水平

21世纪是生命科学的世纪

分子生物学是生命科学的带头学科

随着生物高新技术在病理学中应用的不断增多，分子病理学将在此研究领域中占有越来越重要的位置8分子病理技术ppt课件免疫组织化学技术

一、概论：概念

二、方法和原理

三、免疫组织化学方法基本步骤

四、免疫组化染色的一般注意事项9分子病理技术ppt课件一、概论

1.概念：

1）免疫组织化学（immunohistochemistry）

是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的一门学科。

2）免疫组化技术

是在组织细胞原位检测抗原（或抗体）的一种方法，也是在蛋白水平原位检测基因表达的一种方法。10分子病理技术ppt课件2.历史

1914年，Coons等人首次用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫组化的新时代

Sternberger改进并建立了辣根过氧化物酶－抗过氧化物酶（PAP）技术。

80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成为当今生物医学中形态、功能、代谢等综合研究的一种有力工具。11分子病理技术ppt课件

近些年来，由于原位杂交技术、流式细胞仪及图像分析等技术的兴起和应用，使免疫组化引向基因水平和定量检测

形成免疫组化新的分支

杂交免疫组化和定量免疫组化。

90年代初,原位PCR技术的诞生

免疫组化主要是用来原位PCR结果的化学放大和显示，标志着免疫组化技术又进入了一个新的发展阶段。

12分子病理技术ppt课件二、方法和原理

1.按标记物种类分:

免疫荧光法

免疫酶法

免疫铁蛋白法

免疫金法及放射免疫自显影法13分子病理技术ppt课件2.按标记物标记的部位分

直按法（一步法）

间接法（二步法）

桥联法（多步法）

目前应用最为广泛的为免疫酶法

根据三抗、酶的不同又分为

PAP法、APAAP法、BA法

ABC法、LSAB法和SP法等。

14分子病理技术ppt课件3.免疫荧光法

已知的抗体或抗原分子标记上荧光素

与其相对应的抗原或抗体起反应

形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素

荧光显微镜下——荧光的抗原抗体结合部位

检测出抗原或抗体15分子病理技术ppt课件直接法免疫荧光原理示意图16分子病理技术ppt课件间接法免疫荧光原理示意图17分子病理技术ppt课件4.免疫酶组织化学

60年代初，HRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是HRP，其次是AP。

（1）PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB

其灵敏度是免疫荧光法的100-1000倍

（2）ABC法:Ag→Ab1→Bio-Ab2→ABC→DAB

（3)APAAP法:

Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR

（4）LSAB或SP法:

Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SADAB

（AP-SA）→（FR/NBT）18分子病理技术ppt课件直接法免疫酶组织化学原理示意图19分子病理技术ppt课件间接法免疫酶组织化学原理示意图20分子病理技术ppt课件AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAPAPAAPHRP-DABAP-坚固红NBT多步法免疫酶组织化学原理示意图21分子病理技术ppt课件三、免疫组织化学方法基本步骤

1.试剂配制

（1）柠檬酸盐缓冲液

（2）TBS(Tris缓冲生理盐水)

（3）1MTris-HCl缓冲液(pH7.4)

（4）显色液:

（5）Mayer苏木精复染液22分子病理技术ppt课件2.染色步骤

（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；

（2）消化暴露抗原：

（3）去除内源性酶

（4）滴加适当稀释的一抗；

（5）滴加适当稀释的生物素化的二抗；

（6）滴加ABC复合物等三抗；

（7）滴加底物显色；

（8）苏木素复染核，脱水透明封片。

以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。23分子病理技术ppt课件

3.结果判定

HRP-DAB:阳性呈棕黄或棕黑色

AP-Fastred:玫瑰红色

AP-NBT,BCIP:紫蓝色24分子病理技术ppt课件HRP-DAB:棕黄或棕黑色25分子病理技术ppt课件AP-Fastred:玫瑰红色26分子病理技术ppt课件4.对照实验

（1）空白对照：一抗由TBS

或其他无关抗体取代。

（2）阴性对照：二抗和/或三抗一抗

由TBS或其他无关抗体取代。

（3）阳性对照：用含已知靶抗原的切片

作阳性对照。27分子病理技术ppt课件四、免疫组化染色的一般注意事项

1.内源酶的灭活及内源生物素的处理

HRP—3％的H2O2水溶液

含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和细胞形态。

可以用3％的H2O2甲醇液28分子病理技术ppt课件内源性生物素的去除：

目的：正常细胞也含有生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物，导致假阳性发生。

方法：在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。29分子病理技术ppt课件2.消除非特异性背景着色

常见于蛋白质(抗体)吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上。

方法：在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，以封闭荷电点不给一抗留有吸附的余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。

最常用的无关蛋白质溶液是产生二抗的同种动物的非免疫血清。30分子病理技术ppt课件3.缓冲液的选择

目的：保证免疫组织化学染色的最佳条件，即合适的离子浓度和pH值。

但不同的酶促反应要求不同的pH值和不同的离子。

HRP免疫组织化学染色需近中性环境，pH7.4-7.6较为合适。

AP--需选碱性缓冲液，pH8.2较为合适。31分子病理技术ppt课件4.抗原修复

目的

石蜡切片,甲醛固定，使抗原性物质或由于形成醛键、羧甲键等原因而被封闭了部分抗原决定簇；或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽.

在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。32分子病理技术ppt课件方法

（1）化学方法：酶--抗原决定蔟暴露

胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等

（2）物理/化学方法：主要有

单纯加热方法：柠檬酸盐缓冲液

高压加热方法：

微波方法：利用热效应和微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。33分子病理技术ppt课件5.一抗的选用、稀释度及孵育时间

一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂

抗体工作稀释度取决于：

①特异性抗体的浓度，即滴度；

②抗体的纯度；

孵育时间：特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度。加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体

室温过夜是较好的方法，但也可用37℃1小时或4℃过夜的方法。34分子病理技术ppt课件6.选择适宜的检测方法

血涂片，骨髓涂片–内源性HRP丰富

APAAP或碱磷酶标记的方法

肝、肾等组织——内源性生物素丰富

PAP方法

一般的免疫组化—ABC和SP35分子病理技术ppt课件7.显色中的一些问题

显色的停止点：目的物达最深染色而背景无着色。显色时间过短，着色过浅；显色时间过长，背景着色又过深，都将影响结果的判断，均应避免。

通常显色结果以阳性对照得出最佳结果的时间为标准。

36分子病理技术ppt课件纳米技术

物质基础：原子力显微镜

纳米技术、信息技术和生物技术----

21世纪社会发展的三大支柱

我国—启动

01.6.29,科技部和中科院—“沈阳材料科学

国家（联合）实验室”。这一装备先进

的实验室将主攻纳米级材料

01.7（3-5),国际纳米材料项目论坛会议上，

科技部将斥资10亿—支持国家纳米技术，

资金在5年内全部到位37分子病理技术ppt课件

纳米技术--在10-7-10-9m范围内，对物质内原子、分子的运动和变化进行研究、操纵和加工的技术。

纳米（nm）也即10-9m。纳米技术的诞生，使人们认识事物的本质和变化规律达原子水平。38分子病理技术ppt课件纳米技术最早在材料科学中应用

目前已取得了较