鼠疫检测新技术新方法详解演示文稿

鼠疫检测新技术新方法详解演示文稿本文档共33页；当前第1页；编辑于星期二\8点19分（优选）鼠疫检测新技术新方法本文档共33页；当前第2页；编辑于星期二\8点19分一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。

核酸的分离与纯化内容：聚合酶链式反应(PCR技术)

核酸杂交技术本文档共33页；当前第3页；编辑于星期二\8点19分核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。

破碎细胞（细菌）

技术流程核酸提取

核酸纯化本文档共33页；当前第4页；编辑于星期二\8点19分材料的前处理细胞破碎，核酸释放核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解缓冲液本文档共33页；当前第5页；编辑于星期二\8点19分全自动核酸、蛋白提取仪本文档共33页；当前第6页；编辑于星期二\8点19分聚合酶链式反应（PCR技术）

简史：1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人发明聚合酶链反应（PCR），随后，Mullis所属公司PE推出第一台PCR自动化热循环仪。本文档共33页；当前第7页；编辑于星期二\8点19分基本原理：本文档共33页；当前第8页；编辑于星期二\8点19分基本步骤本文档共33页；当前第9页；编辑于星期二\8点19分本文档共33页；当前第10页；编辑于星期二\8点19分实时定量PCR仪PCR仪本文档共33页；当前第11页；编辑于星期二\8点19分凝胶成像系统凝胶电泳系统本文档共33页；当前第12页；编辑于星期二\8点19分PCR结果判定（凝胶电泳）本文档共33页；当前第13页；编辑于星期二\8点19分PCR类型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆转录PCR

本文档共33页；当前第14页；编辑于星期二\8点19分PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准：PCR扩增（fra+

pla）

+

胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫本文档共33页；当前第15页；编辑于星期二\8点19分鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物2.鼠疫病人血液、痰液或尸检标本3.自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）4.媒介昆虫本文档共33页；当前第16页；编辑于星期二\8点19分样品处理方法1.煮沸法2.DNA提取试剂盒3.CTAB法4.氯仿抽提法本文档共33页；当前第17页；编辑于星期二\8点19分本文档共33页；当前第18页；编辑于星期二\8点19分鼠疫菌PCR检测反应体系10xbufferdNTPsFra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）Taq聚合酶待检测模板（基因组DNA）去离子水本文档共33页；当前第19页；编辑于星期二\8点19分鼠疫菌PCR检测反应程序预变性95℃5min1个循环变性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min变性72℃5min30个循环本文档共33页；当前第20页；编辑于星期二\8点19分M123456内参基因PlaFra鼠疫PCR检测电泳结果判定阳性结果：内参基因+Pla+Fra阴性结果：内参基因本文档共33页；当前第21页；编辑于星期二\8点19分核酸杂交技术

待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。本文档共33页；当前第22页；编辑于星期二\8点19分二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。本文档共33页；当前第23页；编辑于星期二\8点19分标记检测特点：标记免疫技术=免疫技术+

标记技术抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性本文档共33页；当前第24页；编辑于星期二\8点19分鼠疫标记检测技术ELISA胶体金本文档共33页；当前第25页；编辑于星期二\8点19分ELISA技术原理：1.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.2.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.3.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.4.加入底物,通过颜色变化来测定.本文档共33页；当前第26页；编辑于星期二\8点19分ELISA的类型：间接法本文档共33页；当前第27页；编辑于星期二\8点19分双抗夹心法本文档共33页；当前第28页；编辑于星期二\8点19分ELISA技术在鼠疫检测中的应用1.检测鼠疫F1抗原（or抗体）原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。采用F1抗体包被反应板，加入待测标本，反应除去未结合物质，加入HRP-F1MCAb，如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物，加入OPD底物产生显色反应，反之就无显色反应。所需试剂及器材：HRP-F1McAb冻干剂，F1McAb包被板，鼠疫F1阳性对照、阴性对照，PBS（稀释液）,显色液（邻苯二胺），终止液（2M硫酸）。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等本文档共33页；当前第29页；编辑于星期二\8点19分本文档共33页；当前第30页；编辑于星期二\8点19分本文档共33页；当前第31页；编辑于星期二\8点19分ELISA结果判读：1.目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。（+++）深黄棕色；（++）浅黄棕色；（+）颜色明显可见；（-）无色或颜色很浅2.ELISA检测工作站

标本OD/阴性OD>2.1位阳性。

本文档共33页；当前第32页；编辑于星期二\8点19分ELISA操作注意事项：（一）加样

加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不