重组体的筛选与鉴定

第六章重组体的筛选与鉴定转化子：在DNA分子克隆中，通常将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子；重组子：含有重组DNA分子的转化子；期望重组子（目的重组子）：含有外源目的基因的重组子。本文档共77页；当前第1页；编辑于星期一\21点52分*为什么要进行筛选和鉴定？（1）不带任何外源DNA插入片段，仅由线形载体分子自身连接形成的环状分子；（2）由一个载体分子和数个外源DNA片段组成的重组分子；（3）单纯由数个外源DNA片段连接而成的多聚DNA分子；本文档共77页；当前第2页；编辑于星期一\21点52分转化后的克隆群体：本文档共77页；当前第3页；编辑于星期一\21点52分*鉴定的方法有哪些？载体表型选择法根据插入序列的表型特征选择DNA电泳检测法核酸杂交检测法免疫化学检测法转译筛选法本文档共77页；当前第4页；编辑于星期一\21点52分第一节、载体表型选择法根据载体所携带的标记基因的表型进行选择。一、抗药性标记插入失活选择法二、-半乳糖苷酶显色反应选择法本文档共77页；当前第5页；编辑于星期一\21点52分一、抗药性标记插入失活选择法插入效应:外源DNA片段与载体特定部位连接后，使载体的相关功能发生改变，为重组子的筛选提供信息。插入失活插入表达本文档共77页；当前第6页；编辑于星期一\21点52分抗药性插入失活指的是外源DNA插入载体的抗药性筛选标记中，导致该基因结构破坏而失活，使细胞丧失对抗生素抗性的功能。本文档共77页；当前第7页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第8页；编辑于星期一\21点52分transferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracycline这些克隆是有重组质粒的细菌本文档共77页；当前第9页；编辑于星期一\21点52分lacZ’AmN2H片段COOH片段二、-半乳糖苷酶显色反应选择法本文档共77页；当前第10页；编辑于星期一\21点52分

在LacZ体系中，两个彼此互补的突变基因各自编码产生的多肽产物均无活性，但两个突变体间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性，进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生深蓝色物质，使菌落呈现蓝色。本文档共77页；当前第11页；编辑于星期一\21点52分

当外源基因DNA片段插入载体中LacZ’α肽区段的多克隆位点后，会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补而形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。本文档共77页；当前第12页；编辑于星期一\21点52分X-galLacZ蓝色化合物X-gal本文档共77页；当前第13页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第14页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第15页；编辑于星期一\21点52分第二节、根据插入序列的表型特征选择根据克隆片段为寄主提供的新的表型特征选择重组体DNA分子

本文档共77页；当前第16页；编辑于星期一\21点52分例如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长,当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。本文档共77页；当前第17页；编辑于星期一\21点52分*局限性：克隆的DNA片断是一个完整的基因序列能在原核生物中实现功能表达

本文档共77页；当前第18页；编辑于星期一\21点52分第三节、DNA电泳检测法一、直接电泳检测法二、酶切电泳筛选法三、PCR扩增检测法本文档共77页；当前第19页；编辑于星期一\21点52分一、直接电泳检测法菌落提取质粒单酶切电泳适于插入片段较大的重组子初筛本文档共77页；当前第20页；编辑于星期一\21点52分二、酶切电泳筛选法经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断。

本文档共77页；当前第21页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第22页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第23页；编辑于星期一\21点52分三、PCR扩增检测法利用外源DNA插入位点两侧存在的特定序列设计引物，对外源DNA进行PCR分析。本文档共77页；当前第24页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第25页；编辑于星期一\21点52分电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒

重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段本文档共77页；当前第26页；编辑于星期一\21点52分第四节、核酸杂交检测法

一、原理

具有一定同源性的两条核酸单链（DNA或RNA）在适宜的温度和离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异的复性形成双链。本文档共77页；当前第27页；编辑于星期一\21点52分二、核酸杂交检测方法

本文档共77页；当前第28页；编辑于星期一\21点52分1.核酸探针概念：核酸探针是指带有标记的与目的基因同源互补的一段核苷酸序列。

大小：长度以50-300个碱基为宜种类：DNA探针、CDNA探针、RNA探针本文档共77页；当前第29页；编辑于星期一\21点52分2.探针标记物㈠放射性标记物常用的有32P、35S;㈡非放射性标记物常用的有生物素、地高辛和荧光素等。本文档共77页；当前第30页；编辑于星期一\21点52分3.核酸杂交方法

液相杂交固相杂交本文档共77页；当前第31页；编辑于星期一\21点52分4．杂交膜的选用硝酸纤维素膜:本底浅，与小片段核酸(<200bp)结合不牢，质地脆，不易操作；尼龙膜:韧性好，耐用，结合力强，可与小至10bp的片段共价结合。本文档共77页；当前第32页；编辑于星期一\21点52分5.固相核酸杂交的主要过程：1）核酸的变性；2）变性核酸在膜上的固定；3）预杂交；4）杂交；5）洗膜；6）结果显示。本文档共77页；当前第33页；编辑于星期一\21点52分

1）菌落杂交或噬菌体杂交

把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑的方法。*适于从基因文库中筛选目的基因6.几种常用固相核酸杂交方法本文档共77页；当前第34页；编辑于星期一\21点52分菌落杂交筛选法本文档共77页；当前第35页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第36页；编辑于星期一\21点52分2）Southern杂交

提取总DNA酶切琼脂糖凝胶电泳碱变性转膜固定杂交本文档共77页；当前第37页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第38页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第39页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第40页；编辑于星期一\21点52分

3）Northern印迹杂交(Northernblothybridization)：*不能采用碱变性法。*常采用甲醛、聚乙二醛、二甲基亚砜、甲基氢氧化汞等变性方法。本文档共77页；当前第41页；编辑于星期一\21点52分4.斑点杂交(dothybridization)：直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜上，固定好后再进行杂交。本文档共77页；当前第42页；编辑于星期一\21点52分（1）DNA斑点杂交（2）RNA斑点杂交（3）完整细胞斑点杂交本文档共77页；当前第43页；编辑于星期一\21点52分Control样品标记探针浓度检测本文档共77页；当前第44页；编辑于星期一\21点52分四类核酸分子杂交法的技术路线比较菌落原位杂交菌落或噬菌斑转印到膜上抽提DNA/RNA提取DNA提取RNA裂解细菌或噬菌斑变性核酸样品琼脂糖凝胶电泳变性DNA将核酸点加到膜上将凝胶上核酸变性，转移到膜上将核酸固定在膜上→预杂交→杂交→漂洗膜→放射自显影或显色反应示踪斑点杂交Southern印迹Northern印迹本文档共77页；当前第45页；编辑于星期一\21点52分第五节、免疫化学检测法一、放射性抗体检测法二、免疫沉淀检测法三、酶联免疫吸附测定（ELISA）四、免疫印迹（westernblotting）法本文档共77页；当前第46页；编辑于星期一\21点52分一、放射性抗体检测法1、原理：①一种抗原产生的免疫血清含有好几种IgG抗体，分别识别抗原分子上的不同定子（决定簇），并分别同各自识别的抗原定子相结合；

本文档共77页；当前第47页；编辑于星期一\21点52分②抗体分子能够十分牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯等塑料制品)上，而不会被洗脱掉；③通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素125I标记上。

本文档共77页；当前第48页；编辑于星期一\21点52分2、放射性抗体检测法的过程本文档共77页；当前第49页；编辑于星期一\21点52分二、免疫沉淀检测法原理抗原——抗体凝集反应。2.方法

把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。本文档共77页；当前第50页；编辑于星期一\21点52分菌落沉淀素免疫沉淀检测法本文档共77页；当前第51页；编辑于星期一\21点52分3.缺点：只能检测分泌出细胞的蛋白质改良：采用λcI857溶原性大肠杆菌做受体细胞；将含有抗体和溶菌酶的琼脂小心倒在菌落上。本文档共77页；当前第52页；编辑于星期一\21点52分三、酶联免疫吸附测定（ELISA）（enzymelinkedimmunosorbentassay）①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。本文档共77页；当前第53页；编辑于星期一\21点52分1.原理：一抗（primaryantibody）:

与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：

与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：

二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。本文档共77页；当前第54页；编辑于星期一\21点52分待测基因产物蛋白一抗二抗酶

待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶

本文档共77页；当前第55页；编辑于星期一\21点52分2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品：将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底本文档共77页；当前第56页；编辑于星期一\21点52分（2）一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。一抗本文档共77页；当前第57页；编辑于星期一\21点52分（3）二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。二抗本文档共77页；当前第58页；编辑于星期一\21点52分（4）显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。本文档共77页；当前第59页；编辑于星期一\21点52分本文档共77页；当前第60页；编辑于星期一\21点52分（5）比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。本文档共77页；当前第61页；编辑于星期一\21点52分四、免疫印迹法（westernblotting）1、蛋白质的电泳分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)本文档共77页；当前第62页；编辑于星期一\21点52分点样电泳方向本文档共77页；当前第63页；编辑于星期一\21点52分凝胶中的蛋白质的染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。本文档共77页；当前第64页；编辑于星期一\21点52分SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳本文档共77页；当前第65页；编辑于星期一\21点52分2、将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上——转膜电转移常用的膜：硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等。本文档共77页；当前第66页；编辑于星期一\21点52分Western装置本文档共77页；当前第67页；编辑于星期一\21点52分3、免疫学检测——原理与ELISA相同待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物(显色)PAGE胶待测蛋白辣根过氧化物酶：HRPO本文档共77页；当前第68页；编辑于星期一\21点52分第六节、转译筛选法一、无细胞翻译系统指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物。本文档共77页；当前第69页；编辑于星期一\21点52分用于蛋白质的生物合成研究的体外翻译系统主要有：*大肠杆菌无细胞翻译系统*兔网织红细胞无细胞翻译系统*麦胚无细胞翻译系统本文档共77页；当前第70页；编辑于星期一\21点52分二、转译筛选1、杂交抑制转译法适用于筛选那些高丰度的mRNA2、杂交释放转译法可用于检出低丰度mRNA本文档共77页；当前第71页；编辑于星期一\21点52分1、杂交抑制转译法

原理：mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻