蛋白质高效液相色谱技术

高效液相色谱法在蛋白质

分离中的应用陈

檬S1030624张双健S1030621郭传龙S1030622石晨阳S1030623汪菊芬S1030625本文档共31页；当前第1页；编辑于星期三\18点16分高效液相色谱技术特点概述1HPLC系统各组分介绍；2流动相的要求及准备过程354HPLC色谱技术与其他技术联用5HPLC应用举例6现状与展望6本文档共31页；当前第2页；编辑于星期三\18点16分

应用范围广高灵敏度高效高压分析速度快HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。特点本文档共31页；当前第3页；编辑于星期三\18点16分根据分离机理蛋白质HPLC又可分为1243高效凝胶过滤色谱(HPSEC)高效离子交换色谱（HPIEC）高效亲和色谱（HPAFC）反向高效液相色谱（RP-HPLC）本文档共31页；当前第4页；编辑于星期三\18点16分高效液相色谱仪本文档共31页；当前第5页；编辑于星期三\18点16分常用的HPLC仪Waters公司Agilent公司岛津公司等本文档共31页；当前第6页；编辑于星期三\18点16分一进样系统进样方式隔膜进样*阀进样

自动进样

停流进样本文档共31页；当前第7页；编辑于星期三\18点16分六通阀进样

高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。

上样分析本文档共31页；当前第8页；编辑于星期三\18点16分开始分析废液样品

淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液

淋洗液至分离柱定量环进样（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）样品环本文档共31页；当前第9页；编辑于星期三\18点16分进样方式部分装液法

进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。缺点是易产生由进样引起的峰展宽

完全装液法

进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性本文档共31页；当前第10页；编辑于星期三\18点16分二输液系统在线脱气装置梯度仪高压输液泵输液系统本文档共31页；当前第11页；编辑于星期三\18点16分高压输液泵

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。流量稳定流量范围宽输出压力高液缸容积小密封性能好，耐腐蚀

本文档共31页；当前第12页；编辑于星期三\18点16分柱塞往复泵流量不受柱阻影响泵压可达400kg/cm2输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗更换流动相，特别适合再循环和梯度洗脱本文档共31页；当前第13页；编辑于星期三\18点16分三分离系统分离系统*色谱柱连接管恒温器本文档共31页；当前第14页；编辑于星期三\18点16分色谱柱柱效高选择性好分析速度快本文档共31页；当前第15页；编辑于星期三\18点16分进入色谱柱样品的处理本文档共31页；当前第16页；编辑于星期三\18点16分柱的使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。②应逐渐改变溶剂的组成。③一般说来色谱柱不能反冲，会迅速降低柱效。

本文档共31页；当前第17页；编辑于星期三\18点16分④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。⑤需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。

⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。柱的使用和维护注意事项

本文档共31页；当前第18页；编辑于星期三\18点16分四检测系统本文档共31页；当前第19页；编辑于星期三\18点16分要求灵敏度高

噪音低

适用范围广重复性好

本文档共31页；当前第20页；编辑于星期三\18点16分UV检测器本文档共31页；当前第21页；编辑于星期三\18点16分数据处理和计算机控制系统恒温装置在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。采集处理分析数据控制仪器色谱系统优化本文档共31页；当前第22页；编辑于星期三\18点16分流动相的要求反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙腈。一般情况下甲醇-水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙腈-水做初始实验，与甲醇比，乙腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185-205nm处检测的要求。与检测器相适应溶剂的纯度

粘度小

沸点低固体残留物少

与色谱系统相适应本文档共31页；当前第23页；编辑于星期三\18点16分流动相的准备调整PH根据所分离蛋白质及色谱柱决定流动相脱气滤膜过滤目前实验室主要用的是超声15min左右溶剂使用前都必须经0.45μm滤膜过滤，以除去杂质微粒。分清有机相滤膜和水相滤膜，对于混合流动相，在混合前过滤本文档共31页；当前第24页；编辑于星期三\18点16分合适的波长合适的柱温蛋白样品的性质本文档共31页；当前第25页；编辑于星期三\18点16分HPLC与其他色谱光谱技术的联用CEMSUFCECEMSHPLC本文档共31页；当前第26页；编辑于星期三\18点16分高效液相色谱—质谱蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。高效液相色谱—毛细管电泳当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离本文档共31页；当前第27页；编辑于星期三\18点16分反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定应用实例色谱柱流动相梯度洗脱其他C5柱(100mm*4.6mm5μm，Ph-enomenex公司，美国A相:10mmol/LTris缓冲液(pH8.5);B相:乙腈;流速:1mL/minB相体积分数变化为:0～15min,15%～25.5%;15～21min,25.5%。进样量20μL柱温25℃本文档共31页；当前第28页；编辑于星期三\18点16分本文档共31页；当前第29页；编辑于星期三\18点16分高效液相色谱目前多用于蛋白质的定量分析，对于大样品的分离纯化成