动物干细胞技术简介

关于动物干细胞技术简介第1页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第一节干细胞简介干细胞的定义自我更新和分化潜能的细胞,在细胞发育过程中处于较原始阶段.干细胞的分类干细胞有两方面区别于其它细胞的特征：

1，可分化为与自身完全相同的细胞，2，可生产出特异性分化的细胞。

根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为两类：胚胎干细胞及成体干细胞。第2页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三1.带间充质干细胞：大量存在于脐带组织中，具有胚胎干细胞类似的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富、取材方便、无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，疗效显著，可以扩增和传代，同时又没有配型、排斥等问题，不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，也是最具临床应用前景的多能干细胞。2.骨髓间充质干细胞：人体骨髓干细胞细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，从自体骨髓提取间充质干细胞，虽然技术门槛比较低，但需要抽取病人大量骨髓（往往难以做到），其干细胞数量也难以稳定满足临床治疗的要求。因此骨髓间充质干细胞有一定的局限。第3页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三3.脐带血干细胞：脐带血除了包含正常血液的红细胞、白细胞，淋巴细胞外，还包含单个核细胞、造血干细胞。目前最具应用价值的是利用脐血中的造血干细胞治疗白血病（骨髓移植）。利用脐带血所含的单个核细胞和造血干细胞治疗血液病以外的疾病，由于所含干细胞数量稀少（仅占脐血细胞的0.98%），虽然有一定的治疗效果，但不能等同于真正意义上的间充质干细胞治疗，可作为间充质干细胞治疗的补充。4.胚胎干细胞：存在于早期胚胎，获取胚胎干细胞来源比较困难，道德伦理风险不容忽视，因此胚胎干细胞在临床治疗中使用颇受争议,胚胎干细胞，又称全能干细胞，存在于未发育成熟的胚胎，高水平表达端粒酶，可分化为除构成脐胎盘，脐带等之外的任何一种特定类型细胞。即能长成动物的任何组织和器官。第4页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三(1)全能性干细胞它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。

(2)多能性干细胞这种干细胞具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少12种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。

(3)单能干细胞也称专能或偏能干细胞。这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。第5页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第二节胚胎干细胞的特性形态学特征ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠ES细胞的直径7μm～18μm，猪、牛、羊ES细胞的颜色较深，直径12μm～18μm。第6页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三特异性标志分子的表达ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原（Stagespecificembryonicant，SSEA），而且可以检查到OTC4基因的表达，这两种蛋白是发育全能性的标志。ES细胞中AKP及端粒酶活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。ES细胞的多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。将ES细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形成类胚体。将ES细胞在特定培养基进行培养，可以定向分化成特定组织，如ES细胞在含有白血病抑制因子（LIF）和维生素A酸（RA）的培养基上，可以分化形成全壁内胚层，将ES细胞与胚胎细胞共培养或将ES细胞注入囊胚腔中，ES细胞就会参与多种组织的发育。第7页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三细胞周期的特征端粒酶一种自身携带模板的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，RNA组分中含有一段短的模板序列与端粒DNA的重复序列互补，而其蛋白质组分具有逆转录酶活性，以RNA为模板催化端粒DNA的合成，将其加到端粒的3′端，以维持端粒长度及功能。第8页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第三节胚胎干细胞的分离培养分化抑制物的选择和培养基的设计早期胚胎的选择及培养分离及培养过程ES细胞的鉴定ES细胞的冷冻保存ES细胞系的建立及保存第9页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第10页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第11页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第四节胚胎干细胞的定向分化胚胎性干细胞定向分化的常用策略分化细胞的鉴定与纯化第12页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三干细胞应用细胞替代治疗角膜病、糖尿病、帕金森病实例组织替代治疗如皮肤、软组织、骨骼等组织病变器官替代无排斥反应的器官移植第13页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三干细胞培植眼角膜进行眼角膜移植修补手术干细胞培植心肌细胞治疗原发性心脏病第14页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三骨髓干细胞可以自行转移到人脑，并可以转变为功能齐全的脑细胞治疗脑损伤、老年痴呆症以及帕金森氏综合症

第15页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三骨髓间充质干细胞加入造血干细胞造血干细胞增殖分化第16页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第17页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三双刃剑人类基因组计划引发伦理、法律和社会问题克隆人与人兽杂交克隆造成伦理观念的冲击生物技术被别有居心者的使用第18页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第19页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三动物胚胎干细胞的分离培养技术

EmbryonicStemcells（EScells）一、概述二、胚胎干细胞研究的意义三、胚胎干细胞研究的历史四、胚胎干细胞分离培养的基本程序五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景第20页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三胚胎干细胞技术

EmbryonicStemcells(EScells)一、概述哺乳动物胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）一般是指从早期胚胎经体外分化抑制培养分离出来的具有全能性的细胞。ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。第21页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三人胚胎干细胞分离技术途径ICMPGCs第22页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三ES细胞的特点：ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生长；在功能上，ES细胞具有发育的全能性，即具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的能力。ES细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，也可冷冻保存。第23页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三二、胚胎干细胞研究的意义ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；ES细胞是研究细胞分化的理想手段；图ES细胞是研究基因功能的首选细胞；Es细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ES细胞治疗技术将引起一场医学革命；ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。第24页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三二、胚胎干细胞研究的历史1、1981年Evans和Kaufman获得小鼠ES细胞系2、1988年Doetschman获得仓鼠ES细胞系3、1994年Wheeler和Robert获得猪ES细胞系4、1998年Thomson获得人的ES细胞系5、2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的JamesThomson研究小组分别获得诱导多能性干细胞（inducedpluripotentstemcell，iPS细胞）第25页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三四、胚胎干细胞分离培养的基本程序(一)选择抑制细胞分化的培养体系1、饲养层培养体系2、条件培养体系3、培养液中添加分化抑制因子体系第26页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三四、胚胎干细胞分离培养的基本程序（二）早期胚胎的选择（三）胚胎干细胞的分离（四）胚胎干细胞的保持（五）胚胎干细胞的鉴定（六）胚胎干细胞的分化潜力验证第27页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景1、根据细胞的分化特点建立更有效的培养体系2、加强胚胎干细胞体外诱导分化研究3、提高家畜胚胎干细胞的分离水平4、加速胚胎干细胞在医学上的应用第28页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第七节嵌合体Chimera

嵌合体动物：指由2个以上不同的受精卵或3个以上的配子相结合，有不同基因型的细胞群所构成的复合体。嵌合体动物制作方法：1、集合（凝集）法：在卵裂阶段使2个以上的胚胎发生粘着和结合。2、注入法：在临近着床的胚泡期，用显微操作方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。

第29页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三研究现状：

家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间取得成功（绵羊、牛等），而且在异种间也得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体，该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造特异性状的新奇物种，从而为动物园展示了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学系统的机理。第30页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三哺乳动物嵌合体生产基本方法示意图12第31页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三小鼠胚胎囊胚腔注入嵌合法第32页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三嵌合体猪Femalepiglet6899developedfromaDuroc-Pietrainblastocyst(redandblackpigmentation)injectedwithGermanLand-racePGCs(whitepigmentationonheadandlegs).

(B)Chimericpiglets7003(male)and7006(female)withredareasacrossthebackdevelopedfrom‘‘red’’DuroccellsinjectedintoLandraceblastocysts.第33页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第34页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三诱导产生多能性干细胞的研究里程碑式的科学突破第35页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三细胞重编程的研究概况第36页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三核移植核移植试验最初是在两栖动物中实现的，通过将体细胞核注入到去核卵母细胞中。迄今，人们已经获得了多种核移植动物，也建立了来源于核移植胚胎的胚胎干细胞系。第37页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三体细胞核移植试验也具有很大的局限性克隆的效率极低产生的许多后代在各个阶段都体现出严重的发育异常由于需要卵母细胞，核移植实验在人类中的应用受到强烈的伦理学质疑这些不足，都制约了核移植技术的进一步发展和应用。第38页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三

将成熟的体细胞与多潜能的细胞（ES细胞、胚胎癌细胞等）融合，或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞，也可以在一定程度上使体细胞发生重编程。利用这两种方法，可以实现某些多功能性标志分子的重新表达和多种分化潜能的获得。但是，体细胞与多能性细胞的融合率较低，融合之后的细胞具有两套染色体，并且在移植后会发生排斥现象，这就制约了细胞融合的临床应用。第39页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三有没有相对简单，又可摆脱材料来源和伦理学诸多限制，重编程的效率和程度都十分可观的新方法呢？第40页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三里程碑式的科学突破2006年11月20日，日本京都大学的山中伸弥（ShinyaYamanaka)和美国威斯康星大学的詹姆斯·汤姆森（JamesThomson）分别在《细胞》和《科学》杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。第41页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三詹姆斯·汤姆森小组的论文发表在11月20日的《科学》杂志上第42页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三俞君英是11月20日《科学》杂志论文的第一作者第43页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三2006年8月，日本科学家山中伸弥小组首先在小鼠身上取得成功第44页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三诱导产生的多功能性干细胞2006年，Takahashi和Yamnaka将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导产生的多功能性干细胞”（inducedpluripotentstemcells,iPS细胞）。这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态，因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。第45页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三在研究诱导多功能性干细胞产生的原理机制之前，先了解一下体细胞重编程逆转为干细胞的研究进展体细胞重编程的过程体细胞重编程的原理体细胞不经过胚胎逆转为多能干细胞的方法第46页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三成体细胞核的重编程1.核重编程：核移植后供体核停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表达程序状态。此过程包括：染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、X染色体失活等。第47页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三

1.1.DNA甲基化

1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-42.重塑核结构主要有包括核纤层A、B、C三种核纤层蛋白的重塑第48页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第49页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三3.细胞质重编程—miRNAmiRNA是决定细胞分化方向的因子。细胞中miRNA成分的改变能提高细胞对调节基因表达重编程。第50页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三接下来，介绍一下体细胞重编程不经过胚胎逆转为多能干细胞的方法之一：通过特定基因的表达将体细胞重编程过程逆转为干细胞。“基因重新编排技术”，借助“逆转录酶病毒”为载体,即向皮肤细胞中植入一组4个基因(Oct4,Sox2,c-myc和Klf4)，通过基因重新编排，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。这种被改造过的细胞称作“iPS细胞”。第51页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三下面简单介绍一下这些研究中所用到的多能性相关因子Oct4,Sox2,c-myc和Klf4在多能性调控中的作用。第52页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三1.Oct3/4Oct-4（也称Oct-3）属于POU转录因子家族的一员[1~3]。是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是全能性的标志，它能够促使ICM形成、维持胚胎干细胞未分化前状态并促进其增殖。第53页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三2.SOX2基因SOX2基因是编码转录因子的主控基因（mastergenes）家族的一个成员。转录因子是些与DNA结合并调节其他基因表达的蛋白质第54页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三3.癌症基因c-MYC癌症基因c-MYC，是一种最容易过渡表现于人类的致癌基因，它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES细胞的分化。第55页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三4.Klf4Krueppel-likefactor4，KLF4上皮锌指转录因子Klf4(旧称GKLF)调节体外细胞的增生与分化第56页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三iPS细胞诱导机制已分化的细胞导入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4病毒逆转录胚胎干细胞培养条件和筛选Ips细胞第57页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三诱导多功能细胞第58页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第59页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三我们已经了解了体细胞重编程的原理和诱导多功能干细胞的产生机制，下面让我们再深入了解一下Ips细胞的研究概况和Ips细胞系建立的一些重要环节。第60页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三Ips细胞的研究概况（研究方法）这是一种具有很强创新性的研究方法：通过外源导入与多功能相关并且能使重组细胞恢复全能性的转录基因来诱导体细胞核发生重新编程，从而使体细胞转变成多能性干细胞。这种方法所受的启示来源于“ES细胞-体细胞融合实验”。细胞的多能性收到许多因子精密而又复杂的调控。ES细胞和体细胞融合后能诱导体细胞核的重新编程，ES细胞中存在着一些因子，这些因子对于多能性的建立可能至关重要。第61页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三第62页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三Ips细胞的研究概况（两个相关实验）Ips细胞首先由科学家Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。实验原理如下：利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多功能性有关的基因：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4。利用多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选，最终的到了ips细胞，这种细胞的功能和性能几乎和胚胎干细胞一样。另一个实验的对象是人类皮肤成纤维细胞的重编程，而实验的过程和上一个实验基本相同；。只是对所筛选的转录基因做了一下修饰：去掉了肿瘤相关因子c-Myc，使ips细胞的生产更加安全第63页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三Ips细胞系建立的一些重要环节

（几种因子的发现过程）日本科学家发现ES细胞中那个存在着一些因子，这些因子对于多能性的建立可能至关重要。科学家对24个与多能性维持相关的候选基因导入小鼠成纤维细胞中，依次去掉其中一个基因，最后在得到的10个基因中发现了4个至关重要的基因，其中任何一个缺失都将导致实验的失败，这4个基因中的任意2个或3个组合都无法形成具有ES细胞特性的ips细胞。从而确定了：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4这4种基因第64页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三人类ES细胞能够通过细胞融合实验室体细胞发生重编程。美国科学家比较了人类ES细胞和髓前体细胞的基因表达谱，挑选出许多在ES细胞和髓前体细胞的基因表达谱，挑选出许多在ES细胞中相对高表达的基因。再根据这些基因在多能性调控中的已知功能对其进行了排序，从中选出14个候选基因。将这些基因以不同的组合方式导入一种由人类ES细胞分化得到的间充质样细胞后，检验了不同基因的导入对这种细胞重编程的作用。最后锁定了4种因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28.第65页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三Ips细胞系建立的一些重要环节

（Ips细胞的筛选）

Ips细胞的筛选：主要有三种方法：形态学筛选、药物筛选和选用对多能性更为关键的基因作为报告基因。其中利用Fbx15对ips细胞进行筛选，原理是Fbx25对于多能性的维持和胚胎的发育来说是不可缺少的基因，所以Fbx25作为筛选ips细胞的报告基因。仅利用形态学的标准来代替报告基因的筛选。Maherali等人发现，仅仅依靠形态学筛选可能就足以建立ips细胞系。后来的研究证实了在不对供体细胞做任何额外遗传修饰的情况下，仅依靠形态学筛选的标准对细胞进行筛选也能够分离出小鼠的ips细胞。 利用基因重组技术建立了具有药物抗性基因的体细胞，这些细胞的抗性受内源性Nanog或Oct4表达的调控。这两个基因的作用是维持细胞多能性，从而利用这种筛选的方法建立了稳定的ips细胞系，这些细胞系在各个方面都表现出了极为相似的特性。第66页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三iPS细胞的应用价值和发展方向第67页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三1、利用iPS细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，加速对多能性调控机理的深入研究。2、获得的方法相对简单稳定，不涉及胚胎的破坏，无伦理道德限制。3、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。4、可望制造特定病人来源的iPS细胞，用“个性化”移植来治疗诸多疾病。第68页，讲稿共75页，2023年5月2日，星期三诱导