内源激素测定方法

内源激素的提取、纯化和测定各时期取强、弱势粒置液氮中冷冻后于-80°C冰箱中保存，用于GA3、Z、ZR、IAA、ABA的提取和测定。激素的提取和纯化参照陈远平伽的方法并稍加改进，具体如下：0.5-1.0g(叶片为1.0g,籽粒为0.5g)］80%甲醇约4+4+4+4ml(4ml磨，12ml洗)冰上研磨成匀浆14C浸提12h4C5000rpm离心15minI上清液，50ml离心管冰箱保存(F0650,6个)沉淀1+80%甲醇约10ml (1)4C5000rpm离心15min1沉淀重复(1)1合并上清液于50ml离心管(20+10+10ml)136C旋转蒸发浓缩至5ml-10ml［约用1ml80%甲醇冲洗残余至浓缩瓶中］［转速在173-193左右，吸附在壁上为止］［温度32以上时拔掉插头］1超纯水水洗2次，每次3ml，简单震荡，合并10.1gPVPP，4C冰浴振荡1h-70C冰箱，完全冻结14C冰箱融化14C10000rpm离心15min上清液1冷阱冷冻干燥（超低温冰箱预冻2h）1ml甲醇溶解，1ml甲醇润洗15ml100%甲醇活化C18小柱15ml80%（v/v）甲醇平衡，弃去用于活化和平衡的甲醇1样品洗液过Sep-PakC18小柱1用5ml100%甲醇洗脱1收集过柱液样品液和洗脱液分别浓缩至十，上机前用流动相1ml溶解10.45pm微孔滤膜过滤10pl进样以上处理都在弱光下进行。激素测定采用高效液相色谱法（HPLC）。色谱条件：DubheC184.6X250,5pm,流动相：乙氤-甲醇-0.6%乙酸（体积比5:50:45），流速：1.0mlmin-1,梯度洗脱见表1，检测波长254nm；柱温30°C，进样量10pl。样品回收率为96.5±2.6%，每一个样品至少重复4次。外标法定量。表1 梯度洗脱程序时间(min)甲醇（%）0.6%冰乙酸（%）00100.01050.050.03050.050.0冷阱冷冻干燥仪使用方法：关紧阀门一打开开关一选择maindrying一选择No一待压强小于1之后再将样连上。 结束时：standby—enter一关机，开阀门。连接浓缩仪时：开始时要先确保浓缩仪达到最大转速再连接；结束时要先放气再停止浓缩仪。标曲的配置先配（高浓度）单标，尽可能称取一致重量的ABA.IAA.ZR均0.0007g，溶于5ml甲醇于10ml离心管中，浓度均为140ppm配（低浓度）单标，用以上母液分别吸取100ulABA 2ml，即稀释20—►1900ul甲醇倍，浓度为7ppm。特殊：GA3配到14ppm——100ulGA3900ul甲醇次得到的单标作为上机用用（高浓度）单标配混标，包括ABA.IAA.GA3.ZR，方法如下：3.5ppm7ppm10.5ppm14ppm21ppmABA50ul100ul150ul200ul250ulIAA50ul100ul150ul200ul250ulGA3(7ppm)100ul200ul300ul400ul500ulZR50ul100ul150ul200ul250ul甲醇1.75ml1.5ml1.25ml1ml0.75ml2ml2ml2ml2ml2ml单标进样顺序：ZR、GA3、IAA、