WesternBlot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜

WesternBlot技术专辑之胶电泳和转膜

倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏

胶，配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量固然有打算性的影响，这个配胶的比例，在

《分子克隆》上有具体的论述，信任大家都不难查到。简洁无视的问题主要在于过硫酸钱

（AP）肯定要颖一一最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度,超过2周的AP扔掉算了,

或者己经反复翻开使用屡次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失

一胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），由于相对配胶的其他组分，AP算最活泼分

子一一假设还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那确定是你自己找骂，不

值得怜悯。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex（原来的FMC）有商品化的丙烯酰胺

母液，很贵，也很好一一配出的胶对200KD以上的蛋白的区分率高于一般胶，条带清楚秀丽,

惋惜始终没有搞清楚配方的奇特；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯

酰胺粉尘严峻过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种

比例各种梳孔大小多少任君选择，翻开即用，固然更直接便利，更吸引人的是结果秀丽，区

分率高，特别是重复性好，条带真正是“razorsharp”啊！寻常都能用这么豪华的东西心情

固然超爽啊，试验紧凑又轻松，效率也更高啊！假照试验都能这么“好马配好鞍”，想必更简

洁出结果，也就更简洁拿经费吧！什么时候我们的试验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen

旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）r都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这

种铺张品寻常流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了的优待活动，买3盒Nu预

制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你莫非就没有一点非份之想的冲动？

上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地

“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，依据说明把握电流，不要过多重复使用电泳Buffer

（别小气，重复使用会降低缓冲力量的），好似根本不会出问题了。当预染的Marker告知

你，你要区分的蛋白已经到达最正确区分区一一分别胶的2/3处，0K,电泳完毕了。

电泳结果检查：假设要做WesternBlot,是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何

再进展下一步转膜固然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以区分lug左右的条带，是最经

济通用的蛋白胶电泳染色方法。银染操作简单一些但区分率高很多，可以区分2-5ng蛋白。

可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不行逆结合，会干扰后面的WesternBlot

试验，很多人会选择省略掉这一步一一同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以

说明问题。假设想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPROTangerine——这种金色荧光蛋白

染料灵敏度很高一一检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用格外简洁，最重要的是由于不用酸

碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活

性蛋白的检测（比方染色后还需要在胶上进展活性检测等等）。惋惜SYPROTangerine价格

挺贵的，500ul（5000x）要2022元，即使很节约的用只够或许100屡次呢。所以最经济实惠

的方法是：丽春红S,直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽

春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。

转膜：经过电泳分别后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤一一从胶转移到膜上固定，才

能用各种方法进展WesternBlot的检测和显色，而且为了防止没有电场的状况下已经分别

的蛋白条带集中，转移要尽快进展转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布

上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。WesternBlotting亦

是如此，没有选择好适宜的转移膜是无法做出秀丽的结果的。因此，选择适合的转移膜，要

让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的试验。

WesternBlot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（NitrocelluloseBlotting

Membranes,NO和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）,此外也有用尼龙膜、DEAE纤

维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些试验呢？选择的依据主要有：a.膜与目的蛋白分子

的结合力量（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的

大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.假设

后继试验有其他要求，比方要做蛋白测序或者质谱分析，还要依据不同目的来选择不同的转移

膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。

首先来比较下这几种膜的特点

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灵敏度和分高高高

辨率

背景低较高低

125—200ug/cm2（适合于

结合力量80-110ug/cm2>400ug/cm2SDS存在下与蛋白质的结

合）

材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高

溶剂耐受性无无有

操作程序缓冲液润湿,避开气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿

常规染色，比较于NC膜，

常规染色，可用放射性和可用考马斯亮蓝染色，可

检测方式不能用阴离子染料

非放射性检测用于ECL检测，快速免疫

检测。

0.45um一般蛋白低浓度小分子蛋

0.2um一分子量小于20kD白、酸性蛋白、糖

适用范围蛋白蛋白和蛋白多糖糖蛋白检测和蛋白质测序

0.lum一分子量小于7kD蛋（主要用在核酸检

白测中）

价格价格较廉价廉价较贵

1.硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合力量，而且适用于

各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景

低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比方不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排

出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比方NC膜很简洁封闭，也不需要特

别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在适宜的条件下可以稳定保存很长时间，

Schleicher&Schull公司的一个试验说明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5

年照旧保持免疫识别特性，照旧可以得到清楚可信的WesternBlot结果。不过要留意的是

纯的硝纤膜在比较脆，又简洁卷，操作要留神，不适合用于需要屡次重复清洗的用途——因

为经不起屡次“熬煎”。选择硝纤膜时要留意的是选择适宜的孔径，通常20KD以上的大分

子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，假设小于7KD的话最好选择

0.luni的膜。另外还要留意选择纯的NC膜一一混有含醋酸纤维(CM)的NC膜结合力会有所

降低。另外提示一句：由于NC膜上结合的蛋白会由于一些去污剂而被代替，因此在封闭时

最好使用较温存的Tween20,而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果最好)。

硝纤膜最为大家生疏和认可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL,另外

罗氏、Invitrogen、GE(Amersham)>SantaCruz等公司都有供给各式的硝纤膜(估量OEM

的可能性比较大，不过有时挺惊异的，OEM的有时比生产厂家卖的还廉价)。Schleicher&

Schull的名字拗口一一那或许需要舌头在口腔里经过假设干次不同弧度和不同速度的上下来

回准确运动再协作适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个供给硝纤膜的厂家照旧广为

人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protrannitrocellulosemembrane和

Optitrannitrocellulosemembrane。前者Protran始终是Schleicher&Schul1骄傲的产

品，这种a100%PureNitrocelluloseMembranes"。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合力

量就越高，所以要增加WB的灵敏度和区分率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。假

设NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面己经提到，会影响蛋白质结合。而Protran在制作过

程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合力量。除了这一点以外，Protran还有

低背景、多孔径选择(0.45,0.2,0.lum)和保存时间长(试验证明膜上蛋白识别时间可长

达5年！真是“路遥知马力”的典范)等优点。但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械

耐受力欠佳，需要留神操作，假设担忧自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或

者Pall公司的以耐受力著称的BioTraceNTNitrocelluloseTransferMembrane,

Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果外表看

起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增

加这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不简洁卷曲，便利操作，特别是重复标记和洗脱

的试验。不过有的使用过的人反响不如纯NC膜结合力量强。NC膜除了一般的Discs、Rolls

和Sheets以夕卜,像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种便利顾客使用的"sandwich”三明

治形，格外好玩。说它好玩是由于考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和NC

膜纸套成滤纸一NC膜一滤纸的层迭形式，预先切割装订好，便利使用。不过，卷膜确定是

最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必需带手套操作。不知道为什么在国外硝

纤膜会被当作危急品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n

年一一假设非要给这个n加个期限，那就是至少可以用到等我毕业之后。

2.PVDF膜

刚开头做WB的人或许会有这种疑问：为什么试验室的教师（或者师兄师姐们）在教我们

做WB的时候，假设是用PVDF膜做，总是留神翼翼的剪，节约着用，甚至一些边边角角也舍

不得丢掉呢？其实，这不仅是由于PVDF膜比较贵，还由于PVDF膜是做WB的“杀手铜”。

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与

硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留力量，机械强度和化学相容性上都更优越的性能

（Pluskal,etal.,1986）.市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80T00口g/cm2,而PVDF膜结

合量是100-200Mg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清

学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原力量并提高抗

体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学

耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为抱负选择；而且单个凝胶的泳道复

本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进展N-末端测序、蛋白消化/肽分别/

内部测序和免疫检测（Kurien,etal.,2022）»特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”

的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的状况下PVDF膜照旧保持本色，笑傲江湖。所

以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，个人阅历，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更

好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一样

0K,但不适合荧光。PVDF膜特别留意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液

平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真消灭这种问题也是自

己欠扁，谁要你不留神呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识

别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附,

背景可能会比前者稍高。

PVDF膜常见的有以下几个品牌

口

公司产口口X名/孔径适用范围参考价格

MilliporeImmobilonTransfer0.45um$212

Membranes0.2urn

Bio-RadImmun-BlotPVDFChemiluminescent,

Membranecolorimetricwestern

blots,

amino-terminal

sequenceandtotal

aminoacid

composition

PiercePVDFMembrane0.45umWestern,Southern,

0.2umNorthern,anddot

blots

PallLifeBioTracePVDFTransfer0.45umNucleicacidand$149

ScienceMembraneproteintransfers.

Proteinsequencing

InvitrogenPVDFMembrane0.45umProteinsequencing,¥1625.8

0.2urnimmunoblotting

WhatmanWestranClearSignal0.45umWesternblots

PVDFMembrane

作为PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为Immobilon-P

(0.45um),-PSQ(O.2um),-FL(用于荧光显色)和BlottingSandwichesforHighTroughput

四种。Immobilon-P膜孔径均一，具有极强的吸附力量，染色性能好、抗溶剂力量强和信噪

比高，有助于提高检测灵敏度，而且开放的孔构造简洁接近被吸附的蛋白质，并有助于去除背

景上没有吸附的探针，可以说是免疫印迹检测抱负的印迹膜。Immobilon-PSQ转印膜是印迹小

分子蛋白质(<20KDa)的抱负选择一一优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。内外表面积较大，

可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。由于不含污染性支撑物或外表活性剂，

Immobilon-PSQ层析谱上的背景峰值微小。Immobilon-FL也是Millipore值得傲慢的产品，

由于这是第一个特地为荧光显色优化的转移膜。通过试验证明，这种膜在Kodak成像系统可以

显示仅7ng的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。这几种膜除了一般的PVDF膜的优点

之外，最大特点就是一个字快。依据Millipore的操作手册，Immobilon可以在保

证质量的前提下缩短福时间到2个小时一一主要是缩短封闭和洗脱时间。这可真是个好消息,

由于坐在那儿等WB结果多铺张时间啊！缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，可以提高试

验效率，利于我们分析试验结果，考虑下步对策嘛。卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以

用来做点杂交，而预裁剪的即用膜更适合高通量等等''用金钱换时间”的试验。再次强调的是,

疏水PVDF膜在用前必需经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半

透亮后用MilliQ水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。

Invitrogen公司的PVDF膜也有大家风范：膜是与两张预裁的滤纸同时供给，便利使用；虽

然一般而言0.2um的膜渗漏少适用性会更强，但Invitrogen的0.45umPVDE膜自有自家优

势——特别适合于低背景，高敏感度的印迹反响，同样需要在乙醇或者甲醇，或者异丙醇中浸

泡5分钟就可以用了。

3.尼龙膜

尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比方dotblot,比较于NC膜来说，

它的优点是结合力强，特结实又松软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高——由于

尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背

景问题尤为突出（据分子克隆HI说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯毗咯烷酮延长封闭时间

可以改善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就简洁从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定

可以缓解这一状况）。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。因此在许多状况下试

验室人员进展邨试验不选择尼龙膜。

尽管如此，一些产品却能“取其精华，去其糟粕”，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹的因素

缩小或者去除，使其成为有效的蛋白转移介质。比方说，化学发光底物做得相当精彩的

Pierce公司，其旗下的BiodyneA&BNylonTransferMembrane就是这样一"^产品。这种

分为A,B两型的尼龙膜做工精良，孔径大小全都，为了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃

背景影响大的缺点，Biodyne承受了适宜的signalto-noise比例来调整，从而到达了

200ug/cm2的蛋白结合力量，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此

之外，B型的Biodyne对于一些带负电蛋白是一种抱负的转移膜，由于它在A型的根底上提

高了正电荷集团的浓度。另外Biodyne相对于NC膜来说还是一种“打不怕，撕不烂，烧不

着（200℃一下）”的“坚韧”的转移膜。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-）

A：实际操作

1.做胶前的预备

1）检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。

2）检查是否有颖的，足量10%APS,没有马上重配。

3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分别胶各组分的用

量。

2.制胶，电泳

1）装好架子。

2）依据下面配方配制分别胶。（单位:ml,Total：8ml）

7.5%10%15%

2XSep.buffer444

30%Gel.sol2.02.74

ddH201.91.20

TEMED8ul8ul8ul

10%APS80ul80ul80ul

在胶上面参加一层蒸镯水，促进胶更好的凝集。

3）待分别胶凝集后，配制浓缩胶。（单位：ml,Total：3.5ml）

3%

2XStacking.buffer1.7

30%Gel.sol0.35

ddHO1.4

TEMED5ul

10%APS50ul

倒好后插入预先预备好的梳子。

4）待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分别胶时，用100-120V

电压。一般电泳时间在1.5小时左右。

B：留意事项及常遇到的问题

1）分别胶不要倒的太满，需要有肯定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

2）上样蛋白量不应超过30ug/nw（载荷面即：假设你的胶槽是5mmX1mm,则载荷面为：

ImmX5mm=5mm2）。

3）gel通常在0.5-lh内凝集最好，过快表示TEMED.APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，

而且电泳时简洁烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。

4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。

5）电泳中常消灭的一些现象：

-条带呈笑脸状，缘由：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

条带呈皱眉状，可能是由于装置不适宜，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或

者两边聚合不完全。

拖尾：样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边集中：加样量过多。

三、转移

在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。

膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF

(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两

种规格：Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)=

A半干法

马上凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电

流，起到转移的效果。由于电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移

时间短，效率高。

1试验条件的选择

电流lmA-2mA/cm2,我们通常100mA/膜，依据目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，

具体可以依据实际适当调整。

目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)

80——1408%1.5-2.0

25——80101.5

15—40120.75

<20150.5

2试验操作

(1)滤纸和膜的预备(在电泳完毕前20分钟应开头预备工作)。

A.检查是否有足够的transferbuffer,没有马上配制。

B.检查是否有适宜大小的滤纸和膜。

C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transferbuffer中。

D.将适宜的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中。

(2)转移

A.在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。

B.将膜铺在靠膜滤纸上，留意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transferbuffer到

膜上，保持膜的潮湿。

C.将胶剥出，去掉stackgel,留神的移到膜上。

D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。

E.将一张靠胶滤纸掩盖在胶上。倒上些transferbuffer,再铺两张靠胶滤纸。

F.装好电转移仪，依据需要选定所需的电流和时间。

G.转移过程中要随时观看电压的变化，如有特别应准时调整。

CATHODE(-)

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CathooeBufler

SDSgel

TrarsferMembrjMe

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AnodeII

RltecPaper/

AnodeBirfterI

Fig.1.Semi-drytransle?stack0ssem附

3留意事项及常遇到的问题

1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸＞=膜＞=胶。

2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

3）由于膜的疏水性，膜必需首先在甲醛中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必需

随时保持潮湿（干膜法除外）。

4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下

滤纸肯定不能弄混，在不能区分的状况下，可以将靠胶滤纸换的。

5）转移时间一般为1.5小时，（1mA-2mA/cm2,10%gel）,可依据分子量大小调整转移时间

和电流大小。

B湿法

我们根本上不用此方法，这里暂不做介绍。

C转移后效果的鉴定

1.染胶

用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。

2.染膜

有两类染液选择，可逆的和不行逆的。可逆的有ponceau-sred、FastgreenFC^CPTS

等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不行逆的染料，

如考马斯亮兰、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就