氨基酸育种及扩大培养

氨基酸育种及扩大培养本文档共67页；当前第1页；编辑于星期三\6点2分目录Chapter1L-谷氨酸菌种选育及培养过程Chapter2L-缬氨酸育种本文档共67页；当前第2页；编辑于星期三\6点2分Chapter1L-谷氨酸菌种选育及培养过程

本文档共67页；当前第3页；编辑于星期三\6点2分第一节谷氨酸生产菌的主要特征现有谷氨酸生产菌的分类现有谷氨酸生产菌的主要特征本文档共67页；当前第4页；编辑于星期三\6点2分CorynebacteriumBrevibacteriumArthrobacterMicrobacterium现有谷氨酸生产菌的分类本文档共67页；当前第5页；编辑于星期三\6点2分现有谷氨酸生产菌的主要特征细胞形态为球形、棒形以至短杆形革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动都是需氧型微生物脲酶强阳性本文档共67页；当前第6页；编辑于星期三\6点2分现有谷氨酸生产菌的主要特征不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶等发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化CO2固定反应酶系活力强异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱α-酮戊二酸氧化能力微弱本文档共67页；当前第7页；编辑于星期三\6点2分现有谷氨酸生产菌的主要特征还原型辅酶Ⅱ(NADPH2)进入呼吸链能力弱柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强能利用醋酸，不能利用石蜡具有向环境中泄漏谷氨酸的能力不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5％以上本文档共67页；当前第8页；编辑于星期三\6点2分第二节谷氨酸生产菌在

发酵过程中的形态变化种子的菌体形态谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态本文档共67页；当前第9页；编辑于星期三\6点2分典型的谷氨酸种子扩大培养与发酵过程示意图本文档共67页；当前第10页；编辑于星期三\6点2分涂片干燥固定染色1min水洗、吸干镜检谷氨酸菌种结晶紫染色过程示意图本文档共67页；当前第11页；编辑于星期三\6点2分种子的菌体形态斜面培养的菌体较细小，一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深菌体细胞多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无分枝细胞排列呈单个、成对及“V”字形，也有栅状或不规则聚块分裂的细胞大小为0.7～0.9×1.0～3.4μm本文档共67页；当前第12页；编辑于星期三\6点2分谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看，大致可以分为3种不同时期的细胞形态：长菌型细胞转移期细胞产酸型细胞本文档共67页；当前第13页；编辑于星期三\6点2分长菌型细胞发酵0～8h或0～10h细胞形态与二级种子基本相似这种细胞多为短杆至棒杆，有的微呈弯曲状，细胞排列呈单个、成对及“V”字形谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态本文档共67页；当前第14页；编辑于星期三\6点2分转移期细胞发酵8～18h或10～20h此阶段细胞形态急剧变化，细胞开始伸长、膨大，在生物素贫乏的条件下，通过再度倍增，从谷氨酸非积累型细胞转变成谷氨酸积累型细胞（产酸型细胞）转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞。产酸速度逐渐加快谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态本文档共67页；当前第15页；编辑于星期三\6点2分产酸型细胞发酵16～20h以后细胞为含磷脂不足的异常形态，呈现伸长、膨大、不规则，缺乏“Ｖ”字形排列，有的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊；有的边缘褶皱及至残缺不齐，但菌体形态基本清楚在发酵后期，细胞较长，多呈现有明显的横隔（1～3个或更多）的多节细胞，类似花生状，产酸高谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态本文档共67页；当前第16页；编辑于星期三\6点2分

谷氨酸发酵感染

噬菌体后的菌体形态

在谷氨酸发酵时感染噬菌体，会使谷氨酸生产菌的菌体形态发生改变，但是感染噬菌体的时期不同，菌体形态变化也不一样发酵前期感染噬菌体的菌体形态发酵中、后期感染噬菌体的菌体形态本文档共67页；当前第17页；编辑于星期三\6点2分发酵前期感染噬菌体的菌体形态发酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明显减少，细胞不规则，发圆、发胖，缺乏“Ｖ”字形排列有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞，类似蛛网或鱼翅状

谷氨酸发酵感染

噬菌体后的菌体形态本文档共67页；当前第18页；编辑于星期三\6点2分发酵中、后期感染噬菌体的菌体形态在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西有细胞碎片，不同于正常发酵的产酸细胞

谷氨酸发酵感染

噬菌体后的菌体形态本文档共67页；当前第19页；编辑于星期三\6点2分第三节育种过程天津短杆菌GDK-9的定向选育谱图天津短杆菌GDK6经原生质体紫外诱变、紫外诱变以及DES化学诱变，依次被赋予酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰胺抗性（KMr+FAr+SGr+GLr）遗传标记，再经分离纯化获得一株L-谷氨酸高产菌GDK-9，其定向选育谱系见图本文档共67页；当前第20页；编辑于星期三\6点2分遗传稳定性试验将目的突变株GDK-9进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，并进行遗传标记验证和摇瓶发酵产酸试验，结果见表传代数246810遗传标记＋＋＋＋＋谷氨酸/g/L79.3479.2679.1779.2179.39本文档共67页；当前第21页；编辑于星期三\6点2分第四节菌种扩大培养及

种子的质量要求溶氧浓度菌种扩大培养的任务种子扩大培养的过程影响种子质量的主要因素本文档共67页；当前第22页；编辑于星期三\6点2分菌种扩大培养的任务菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数

本文档共67页；当前第23页；编辑于星期三\6点2分种子扩大培养的过程斜面菌种的培养菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。

本文档共67页；当前第24页；编辑于星期三\6点2分一级种子培养一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。本文档共67页；当前第25页；编辑于星期三\6点2分二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。本文档共67页；当前第26页；编辑于星期三\6点2分种子罐配料顺序首先，将配料池中冲洗干净，所用糖液尽量用新鲜糖液，依次将水（配料池的2/3体积）、葡萄糖、玉米浆、糖蜜、尿素（用液氨的不用）、磷酸氢二钠、氯化钾（溶液）加入配料池中，用NaOH稀溶液调pH，然后取样分析，加消泡剂，加水定容至刻度线待打料，配料过程中，搅拌始终开启。正确的配料顺序是为了保证培养基的初OD值低和减少培养基副反应发生。本文档共67页；当前第27页；编辑于星期三\6点2分天津短杆菌T6～13的谷氨酸发酵生产培养基成分斜面/%摇瓶种子/%二级种子/%发酵/%蛋白质1牛肉膏0.5NaCl0.5葡萄糖0.12.52.5(淀粉水解糖)13~15(淀粉水解糖)玉米浆0.910.6液

氨K2HPO4·3H2O0.10.1MgSO4·7H2O0.040.060.06Na2HPO4·12H2O0.15KCl0.05琼脂2pH76.86.87本文档共67页；当前第28页；编辑于星期三\6点2分各级种子的质量要求指标斜面种子一级种子二级种子种龄培养18~24h，斜面菌种一般只传三次12h7~8hpH/6.4±0.16.8~7.2光密度/净增OD0.5以上净增OD0.5以上残糖/＜0.5%消耗1%左右无菌检查无无无噬菌体检查无无无镜检菌体生长均匀、粗壮、革兰氏阳性反应菌体生长均匀、粗壮、革兰氏阳性反应菌体生长均匀、粗壮、革兰氏阳性反应本文档共67页；当前第29页；编辑于星期三\6点2分影响种子质量的主要因素培养基构成温度pH溶解氧接种量种龄本文档共67页；当前第30页；编辑于星期三\6点2分培养基构成种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于菌体生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，碳源含量少，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。如果糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使pH降低，菌种容易衰老。培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较容易适应发酵罐的培养条件。发酵培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。本文档共67页；当前第31页；编辑于星期三\6点2分温度种子培养应选择最适温度,幼龄菌对温度变化敏感，应避免温度过高和波动过大本文档共67页；当前第32页；编辑于星期三\6点2分pH种子培养基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌体形态和代谢途径影响很大。种子培养的初始pH不宜过高，培养结束时pH不宜过低。本文档共67页；当前第33页；编辑于星期三\6点2分溶解氧

培养过程中通气搅拌的控制很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区别控制一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。在种子制备过程中，如果溶氧水平过高，会抑制长菌。生产过程中，有时种子培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。本文档共67页；当前第34页；编辑于星期三\6点2分接种量

移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例，称为接种量。接种量的大小与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度有关。本文档共67页；当前第35页；编辑于星期三\6点2分生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施。采用大接种量，种子进入发酵罐后容易适应，而且种子液中含有大量的水解酶，有利于对发酵培养基的利用。大接种量还可以缩短发酵罐中菌体繁殖至高峰所需的时间，使产物合成速度加快本文档共67页；当前第36页；编辑于星期三\6点2分过大的接种量往往使菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵。接种量过小，则会引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，影响种子活力，导致发酵异常等等。本文档共67页；当前第37页；编辑于星期三\6点2分种龄种子培养时间称为种龄菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的控制就显得非常重要。在发酵生产中，种子培养时间不宜太长，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期,菌体量尚未达到最高峰时移种本文档共67页；当前第38页；编辑于星期三\6点2分种龄过于短的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多，发酵周期延长以及因菌体量过少而引起异常发酵等等种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退本文档共67页；当前第39页；编辑于星期三\6点2分Chapter2L-缬氨酸育种本文档共67页；当前第40页；编辑于星期三\6点2分育种标记及其育种目的育种标记育种目的备注Leu-切断L-亮氨酸的支路代谢。Ile-切断L-异亮氨酸的支路代谢。2-TAr解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用；2-TA是L-亮氨酸和L-缬氨酸的结构类似物。α-ABr解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用。α-AB是L-缬氨酸的结构类似物。SGr增强菌体必需生长因子四氢叶酸的生物合成，从而促进氨基酸的生物合成。SG是对氨基苯甲酸的结构类似物。本文档共67页；当前第41页；编辑于星期三\6点2分出发菌株的选择本研究以黄色短杆菌TV10为出发菌株，在进行诱变育种试验之前对该菌进行形态观察并对菌体的某些性状进行了鉴定。培养基菌株生长情况基本培养基生长完全培养基生长完全培养基﹢2%磺胺胍不生长补充培养基﹢2%α-AB不生长补充培养基﹢1%2-TA不生长本文档共67页；当前第42页；编辑于星期三\6点2分菌体生长曲线的测定

取新鲜活化斜面菌种，接入装有25mL完全液体培养基的250mL三角瓶中，32℃，200r/min，振荡培养16~18h后，取1mL菌液到另一相同的完全液体培养基中继续培养，每隔一定时间取样，用蒸馏水稀释20倍后，用752分光光度计于光程1cm、波长620nm条件下测量吸光度（A620nm）。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制菌体生长曲线本文档共67页；当前第43页；编辑于星期三\6点2分原生质体紫外诱变菌体前培养取新鲜活化斜面菌种于完全液体培养基中，32℃，200r/min，振荡培养12h后，取1mL菌液到另一完全液体培养基中继续培养6h，加入终浓度为0.6U/mL的青霉素，继续培养3h。本文档共67页；当前第44页；编辑于星期三\6点2分原生质体形成

取上述经青霉素预处理过的菌液5mL于离心管中，4000r/min离心10min，弃上清，用高渗液离心洗涤2次后，配成菌悬液。加入0.8g/L蛋清溶菌酶，于35℃保温（随时镜检，观察原生质体形成情况）16h，然后以4000r/min离心10min，弃上清，洗涤后用高渗液悬浮，制成原生质体高渗悬浮液。本文档共67页；当前第45页；编辑于星期三\6点2分原生质体再生将上述原生质体高渗悬浮液用高渗液适当稀释，取0.5mL稀释菌液与融化后冷至45℃（水浴保温）的半固体再生完全培养基4.5mL混合后，均匀倾注在已固化的再生完全培养基底层上，32℃培养48～72h。本文档共67页；当前第46页；编辑于星期三\6点2分原生质体形成率和再生率的计算

将经青霉素处理后溶菌酶处理前的高渗菌悬液，用无菌水系列稀释，取0.2mL菌液均匀涂布于完全培养基平板上，32℃恒温培养。根据长出的菌落数计算原菌数(A)将获得的原生质体分别经如下两个过程处理1)用无菌水适当稀释，取0.2mL稀释菌液均匀培养于完全培养基平板上，32℃恒温培养，在完全培养基平板上长出的菌落数即为未形成原生质体的菌数(B)2)用高渗液适当稀释，取0.2mL稀释菌液均匀培养在再生培养基平板上，32℃恒温培养，计数，长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的菌数之和(C)本文档共67页；当前第47页；编辑于星期三\6点2分原生质体形成率(%)=原生质体再生率(%)=式中A-B为原生质体形成数，C-B为原生质体再生数本文档共67页；当前第48页；编辑于星期三\6点2分原生质体紫外诱变

采用15W紫外灯，距离30cm，照射原生质体高渗悬浮液0～25s，然后采用夹层法于32℃恒温箱中培养48h，根据菌落计数，绘制原生质体紫外诱变致死率曲线。本文档共67页；当前第49页；编辑于星期三\6点2分DES诱变采用DES（最终体积百分浓度为1%）进行诱变，测定不同诱变时间的杀菌率，绘制致死率曲线。具体诱变过程如图所示本文档共67页；当前第50页；编辑于星期三\6点2分目的菌株的筛选方法本文档共67页；当前第51页；编辑于星期三\6点2分营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型突变株的选育，分为诱变处理、中间培养、淘汰野生型、缺陷型的检出和鉴定等步骤。本文档共67页；当前第52页；编辑于星期三\6点2分诱变处理根据致死率曲线，按致死率70%~80%的时间进行诱变处理。本文档共67页；当前第53页；编辑于星期三\6点2分中间培养取1mL处理液于装有25mL完全液体培养基的250mL三角瓶中，32℃，200r/min振荡培养过夜。本文档共67页；当前第54页；编辑于星期三\6点2分淘汰野生型(青霉素法)用青霉素钠杀死处于分裂生长的野生型细胞，达到浓缩缺陷型细胞的目的。本文档共67页；当前第55页；编辑于星期三\6点2分营养缺陷型的检出将菌液按一定的稀释度涂布于限制培养基平板上，32℃恒温培养48h～72h。野生菌长成大菌落，缺陷型菌长成小菌落。挑选在完全培养基上长出的与“基本培养基上不生长，含氨基酸的补充培养基上生长”相对应位置的菌落。将检出的缺陷型菌株转接于斜面，以备鉴定缺陷型。本文档共67页；当前第56页；编辑于星期三\6点2分营养缺陷型的鉴定（Leu-或Ile-或Leu-+Ile-）①含缺陷氨基酸平板—划线法：用于菌株数较多时的初步鉴定。用接种环取斜面菌体，依次在“MM、MM+Leu、MM+Ile、MM+Leu+Ile”四种平板的同一编号内划线，32℃培养48~72h。单缺（Leu-或Ile-）：仅在含有L-亮氨酸或L-异亮氨酸以及含有L-亮氨酸与L-异亮氨酸的基本培养基平板上生长；双缺（Leu-+Ile-）：仅在MM+Leu+Ile平板上生长。10L的L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸与L-异亮氨酸混合液。32℃恒温培养48h～72h；本文档共67页；当前第57页；编辑于星期三\6点2分②含菌平板—滤纸片法：用于菌株数少时的准确鉴定。制备含菌平板：将待检菌株经斜面培养后制成菌悬液，用无菌水离心洗涤后涂布于基本培养基平板；用滤纸片法验证：每皿放置三个无菌滤纸片，用20L可调微量移液器依次往滤纸片上加入本文档共67页；当前第58页；编辑于星期三\6点2分结果判定：单缺—在含有所缺氨基酸的滤纸片周围长有菌圈；双缺—在含L-亮氨酸滤纸片与含L-异亮氨酸滤纸片交界处长有菌带本文档共67页；当前第59页；编辑于星期三\6点2分药物抗性突变株的选育方法

(1)药物抗性临界浓度的确定按药物质量浓度梯度制备一系列的平板，将待诱变菌株的菌悬液均匀涂布于药物平板表面上，于32℃培养72h，以确定药物抑制菌体生