大肠杆菌表达系统

外源基因在大肠杆菌中的表达第一页，共八十七页。精选ppt外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统(xìtǒng)成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物第二页，共八十七页。精选ppt外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统(xìtǒng)内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素第三页，共八十七页。精选ppt外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效(ɡāoxiào)表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录(zhuǎnlù)翻译(fānyì)第四页，共八十七页。精选pptPtac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT启动子第五页，共八十七页。精选ppt转录调控机理

具有多顺反子结构，基因排列(páiliè)次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）

正调节因子CAP

负调节因子lacI启动子Lac表达系统以大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)

lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

第六页，共八十七页。精选pptlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统

正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列(xùliè)的结合，进而促进Plac

介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程(jīyīngōngchéng)中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAP第七页，共八十七页。精选pptLac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够(nénggòu)在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。第八页，共八十七页。精选pptLac表达系统

负调节因子lacI在无诱导物情形(qíngxing)下，lacI

基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA第九页，共八十七页。精选pptTac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接(pīnjiē)而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于

trp和lacUV5

启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

第十页，共八十七页。精选pptlac、tac启动子对宿主菌的要求

在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。

当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例(bǐlì)显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。第十一页，共八十七页。精选pptlac、tac启动子对宿主菌的要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq

被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。

但是(dànshì)这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。

需在表达载体中插入lacIq

基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。第十二页，共八十七页。精选pptlac、tac表达系统存在的问题

IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的

毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。

一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG

解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧(yánjǐn)调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录第十三页，共八十七页。精选pptlac、tac表达系统存在的问题lac和tac启动子的转录受温度严紧调控

把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有(jùyǒu)诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。第十四页，共八十七页。精选ppt转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去(chúqù)色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达启动子Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础(jīchǔ)设计、构建的表达系统

第十五页，共八十七页。精选pptTrp表达(biǎodá)系统

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效转录mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶第十六页，共八十七页。精选pptPL

和PR

表达系统

以l噬菌体早期转录启动子PL、PR

为核心构建(ɡòujiàn)的表达系统

在野生型l噬菌体中，PL、PR

启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。启动子第十七页，共八十七页。精选pptPL

和PR

表达系统

转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子(yīnzǐ)之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子(yīnzǐ)来控制cI

基因产物的产生和消失是相当困难的。

因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。

在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落第十八页，共八十七页。精选pptPL和PR

表达系统(xìtǒng)宿主菌中没有cI基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL

或PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。

对宿主菌的要求

用溶源化l噬菌体的大肠杆菌作PL、PR启动子表达载体的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cI857(ts)

l噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。

把cI857(ts)

基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大第十九页，共八十七页。精选pptPL和PR表达系统存在的问题

由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统。

缺陷在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵(fājiào)培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。第二十页，共八十七页。精选ppt

T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件(yuánjiàn)为基础构建的表达系统称为T7表达系统。第二十一页，共八十七页。精选pptT7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到(dádào)很高的水平。第二十二页，共八十七页。精选pptT7表达系统转录调控的机理

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式(fāngshì)。

化学诱导型温度诱导型双质粒系统T7RNA聚合酶T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因？启动子第二十三页，共八十七页。精选pptT7表达系统转录调控的机理

化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中

用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体(zàitǐ)的宿主菌，调控方式为

化学诱导型，类似于Lac表达系统。

T7RNA聚合酶基因(jīyīn)

lac

启动子E.Coli（DE3）T7启动子

目的基因T7RNA聚合酶IPTG诱导(yòudǎo)第二十四页，共八十七页。精选pptT7表达系统转录调控的机理

温度诱导型PL

启动子控制(kòngzhì)T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。

这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

T7RNA聚合酶基因(jīyīn)PL

启动子E.Coli（CE6）T7启动子

目的基因T7RNA聚合酶热诱导(yòudǎo)cI857第二十五页，共八十七页。精选pptT7表达系统转录调控的机理

双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因

两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制(kòngzhì)T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA聚合酶热诱导(yòudǎo)T7启动子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL启动子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpR第二十六页，共八十七页。精选pptT7表达系统存在的问题

T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物(chǎnwù)对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。

解决办法之一

在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。第二十七页，共八十七页。精选ppt营养调控型采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因

phoA启动子或甘油3’-磷酸转移系统ugp

启动子构建表达载体。

这两个(liǎnɡɡè)启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L时抑制，Pi﹤1mmol/L时激活)，具有较高的转录水平。其他(qítā)表达系统第二十八页，共八十七页。精选ppt

糖原调控型采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC)mgl启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动子构建表达载体。

这两个(liǎnɡɡè)启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于Lac表达系统.其他(qítā)表达系统第二十九页，共八十七页。精选pptpH调控型采用大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)赖氨酸脱羧酶基因cadA

启动子构建表达载体。

cadA启动子受培养基中H+浓度，即pH值调控。（在pH﹥8时抑制，pH﹤6时激活，pH=6时转录活力最高）。

该表达系统要求菌体发酵温度控制在27～30℃之间才能使目的基因得到稳定的表达.其他(qítā)表达系统第三十页，共八十七页。精选ppt溶氧调控型采用(cǎiyòng)大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl

启动子，硝基还原酶基因nirB启动子或透明颤菌血红蛋白基因

vgb

启动子构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子fnr的作用位点。

在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活。其他(qítā)表达系统第三十一页，共八十七页。精选ppt溶氧调控型大肠杆菌GJ100有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子控制下的T7RNA聚合酶基因表达质粒，vgb基因的转录是受环境溶氧浓度调控的，在贫氧条件下vgb基因的启动子被激活。

因此，用大肠杆菌GJ100作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧诱导型，菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节，与其他调控模式(móshì)相比更适合于产业化生产过程。其他(qítā)表达系统第三十二页，共八十七页。精选ppt生物素调控型

用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体(zàitǐ)，菌体生长过程中生物素会不断消耗，当浓度到达2ng/ml以下时启动子被激活。

能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻。其他(qítā)表达系统第三十三页，共八十七页。精选ppt强化转录终止的必要性

外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子(fēnzǐ)mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子第三十四页，共八十七页。精选ppt强终止子的选择与使用目前外源基因(jīyīn)表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2

以及T7噬菌体DNA上的Tf。

对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子第三十五页，共八十七页。精选ppt核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录(zhuǎnlù)启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）

核糖体结合(jiéhé)位点第三十六页，共八十七页。精选ppt第三十七页，共八十七页。精选ppt核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列(xiàliè)四个特征结构要素：

位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；

翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子

SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列核糖体结合(jiéhé)位点第三十八页，共八十七页。精选ppt核糖体结合位点对外源基因(jīyīn)表达的影响

SD序列的影响一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低核糖体结合(jiéhé)位点第三十九页，共八十七页。精选ppt核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列与起始密码子之间的序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译(fānyì)效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。

紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍核糖体结合(jiéhé)位点第四十页，共八十七页。精选ppt核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列与起始密码子之间的距离的影响SD序列与起始密码子AUG

之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。

在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约(dàyuē)七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低核糖体结合(jiéhé)位点第四十一页，共八十七页。精选ppt核糖体结合位点对外源基因表达的影响

起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的

5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰(gānrǎo)mRNA在核糖体上的准确定位

目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。核糖体结合(jiéhé)位点第四十二页，共八十七页。精选ppt不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由(zìyóu)能性中等强度规律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多细胞内tRNA的含量密码子生物体对密码子的偏爱(piānài)性第四十三页，共八十七页。精选ppt密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响

由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择(xuǎnzé)。

一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：

外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因第四十四页，共八十七页。精选ppt质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛(guǎngfàn)使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降

解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道第四十五页，共八十七页。精选ppt

外源基因在大肠杆菌中的表达蛋白质的合成是在细胞之中进行的目标(mùbiāo)蛋白在细胞质中表达的主要优点是：表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的20%～40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：

在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒

包涵体存在于大肠杆菌细胞质中

在细胞内表现为可溶性的蛋白质

可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。第四十六页，共八十七页。精选ppt大肠杆菌基因工程菌的构建策略

包涵(bāohɑn)体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建外源基因在大肠杆菌中的表达第四十七页，共八十七页。精选ppt包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成(héchéng)的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵(bāohɑn)体型异源蛋白的表达第四十八页，共八十七页。精选ppt以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的优点在一定程度上保持(bǎochí)表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集

简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。包涵(bāohɑn)体型异源蛋白的表达第四十九页，共八十七页。精选ppt以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的缺点以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。

经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般(yībān)不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体型异源蛋白(dànbái)的表达第五十页，共八十七页。精选ppt包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。在人工条件下，使包涵体溶解并重新(chóngxīn)进入复性途径中。

能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：

清洗剂SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化

促溶剂盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应

混合溶剂如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强

极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体型(tǐxíng)异源蛋白的表达第五十一页，共八十七页。精选ppt包涵体的变性与复性操作

包涵体的复性与重折叠(zhédié)（refolding）包涵体的复性与重折叠的主要任务：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性包涵体型(tǐxíng)异源蛋白的表达第五十二页，共八十七页。精选ppt在细胞内表现为可溶性的蛋白质目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至(shènzhì)没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基，需要形成二硫键的蛋白质大部份被转运到细胞的其他部位。

分泌型异源蛋白(dànbái)的表达第五十三页，共八十七页。精选ppt

这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因trxB缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明(biǎomíng)trxB缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化，蛋白质在trxB缺陷株的细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一·个相当重要的工具。分泌(fēnmì)型异源蛋白的表达第五十四页，共八十七页。精选ppt在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质

在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质需要起始密码，通常为编码甲硫氨酸的ATG。⑴在多数情况下，N端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质(xìngzhì)没有特别的影响，但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物学活力的报道。⑵另外，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质。从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看，这是一个需要引起重视的问题。

第五十五页，共八十七页。精选ppt去除附加的甲硫氨酸有二种方法：

⑴在表达系统(xìtǒng)中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分离纯化后在体外用外肽酶处理。但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨莱酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。第五十六页，共八十七页。精选ppt目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达

与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有(méiyǒu)附加甲硫氨酸目标蛋白。金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。第五十七页，共八十七页。精选ppt第五十八页，共八十七页。精选ppt目标蛋白(dànbái)在周质空间中表达目标蛋白在周质空间中表达的优点⑴大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含最与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。⑵目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。⑶周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。第五十九页，共八十七页。精选ppt目标蛋白外泌表达

把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分离纯化。目前成功的例子主要是采用以下方案:（1）与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达（2）与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达（3）改变培养基的成分归纳现有的研究结果显示这些方法(fāngfǎ)仅对外泌分子量较小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比较低。第六十页，共八十七页。精选ppt四、高效表达目标基因的战略(zhànlüè)和技术表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因提高目标基因mRNA和目标基因产物(chǎnwù)的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞第六十一页，共八十七页。精选ppt四、高效表达(biǎodá)目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计在各种(ɡèzhǒnɡ)表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一段含有各种(ɡèzhǒnɡ)限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对于构建高效表达质粒是至关重要的。由于每一个基因都具有各自独特的5’端结构，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。第六十二页，共八十七页。精选ppt第六十三页，共八十七页。精选ppt第六十四页，共八十七页。精选ppt四、高效表达目标基因(jīyīn)的战略和技术表达质粒的优化和设计

构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离(jùlí)和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，具体表现为：

SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3～6倍翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6～8个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5～7个碱基长度ATG与UAAGGAGG至少相隔3～4个碱基，与AAGAA至少相隔5个碱基；mRNA的翻译才能进行ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。第六十五页，共八十七页。精选ppt

核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA5’端的二级结构，研究表明讨mRNA5’端形成的“茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译(fānyì)的起始。尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA5’端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下第六十六页，共八十七页。精选ppt表达质粒的优化和设计

在构建表达质粒时，充分利用各个(gègè)基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列

能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。

四、高效表达(biǎodá)目标基因的战略和技术第六十七页，共八十七页。精选ppt共表达大肠杆菌稀有(xīyǒu)密码子tRNA基因

表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有：编码Arg的密码子AGA、AGG、CGA、CGG编码Pro的密码子CCC、CCU、CCA编码Cys的密码子UGU、UGC;编码Gly的密码子GGA、GGG编码Leu的密码子CUA、CUC编码Ile的密码子AUA编码Ser的密码子UCA、AUG、UCG、UCC编码Thr的密码子ACA四、高效表达(biǎodá)目标基因的战略和技术第六十八页，共八十七页。精选ppt共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因

由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。

解决(jiějué)这一问题的办法：通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度四、高效表达目标基因(jīyīn)的战略和技术第六十九页，共八十七页。精选ppt在所有的大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)稀有密码子tRNA中，tRNAArg(AGG/AGA)含量最少，而AGG和AGA密码子在真核基因中经常出现。人尿激酶原ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA等基因中都含有较多的AGG和AGA密码子，在大肠杆菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达tRNAArg(AGG/AGA)基因argU后，这些基因的表达水平能明显得到提高。现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构的不同决定了它对翻译过程的影响是有差别的。所有的结论要通过实验才能得出。四、高效表达目标基因(jīyīn)的战略和技术第七十页，共八十七页。精选ppt提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因mRNA和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有(jùyǒu)一定的专一性和选择性。四、高效表达(biǎodá)目标基因的战略和技术第七十一页，共八十七页。精选ppt蛋白水解酶的特点细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋臼质的统计学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp残基的蛋白质，含有ProGlu、Ser、Thr丰富区的蛋白质容易降解，稳定性较差。

在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白水解酶活力往往能达到(dádào)比较高的水平。四、高效(ɡāoxiào)表达目标基因的战略和技术第七十二页，共八十七页。精选ppt提高目标蛋白的稳定性的措施主要有：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积(lěijī)在周质空间，或分泌到培养基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因。对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造。在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。四、高效表达(biǎodá)目标基因的战略和技术第七十三页，共八十七页。精选ppt

但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要表现为：大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的较运和分泌效率一般比较低，不能满足大规馍制备的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速率慢，使高密度发酵比较困难。融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致生物比活力降低，甚至没有活性。融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学的方法切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据，而目前(mùqián)这方面的数据库还不完整。第七十四页，共八十七页。精选ppt四、高效表达目标基因(jīyīn)的战略和技术高密度发酵和工程化宿主细胞大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达(biǎodá)水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达(biǎodá)量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种

第七十五页，共八十七页。精选ppt构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌(jiǎobàn)速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从恨本上解决问题的途径之一。四、高效(ɡāoxiào)表达目标基因的战略和技术第七十六页，共八十七页。精选ppt利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断。改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh2导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3‘-羟基丁酮或乙醇的方向进行。四、高效表达目标(mùbiāo)基因的战略和技术第七十七页，共八十七页。精选ppt构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋日而言，随着发酵后期(hòuqī)各种蛋白水解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。为了使对蛋白水解酶比较敏感的目标蛋白也能获得较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。

rpoH基因编码大肠杆菌RNA聚合酶的r32亚基，r32亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH基因缺陷的突变株己经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。到目前为止，已知的大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株都巳被获得，其中一部分具有实际应用的潜力。四、高效表达目标(mùbiāo)基因的战略和技术第七十八页，共八十七页。精选ppt五、大肠杆菌表达(biǎodá)系统研究的发展趋势构建各种表达(biǎodá)载体

建立新的表达系统

目前研究的重点完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括:

重组蛋白质的正确折叠、构象形成和分泌菌体表面表达技术及其应用重组蛋白质修饰加工研究第七十九页，共八十七页。精选ppt共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确