忧虑康药对动物抑郁行为和血浆cAMP、cGMP的影响及毒性试验研究

忧虑康药对动物抑郁行为和血浆cAMP、cGMP的影响及毒性试验研究【摘要】目的观察忧虑康药对肾阴虚型抑郁模型大鼠行为学和血浆cAMP、cGMP的影响及毒性试验。方法采用灌胃甲状腺素合并慢性不可预见性应激制成肾阴虚抑郁动物模型后，随机分为空白对照组、模型组、六味地黄丸组、氟西汀组、忧虑康低、中、高剂量组，观察各组大鼠敞箱试验和液体消耗试验等行为学变化，采用放射免疫方法检测血浆cAMP、cGMP含量。并进行急性毒性试验，计算小鼠最大耐受量。结果肾阴虚抑郁模型大鼠敞箱试验和液体消耗试验各项指标均显着下降，血浆cAMP含量显着升高；忧虑康药能部分改善大鼠的抑郁行为，六味地黄丸和忧虑康均能显着降低大鼠血浆cAMP含量。小鼠灌服忧虑康药1日最大耐受量为360g/kg，相当于人临床用量的300倍。结论呈量效关系的忧虑康药影响大鼠行为学和调整血浆cAMP、cGMP平衡，可能正是其滋阴解郁的作用机制之一；该药是安全范围较大的药物，提示用于临床是安全的。

【关键词】忧虑康；肾阴虚；抑郁症；环腺苷酸；环鸟苷酸；急毒

TheeffectsandtoxicityexperimentalresearchofYouLvKangonanimaldepressionbehaviorandcAMP,cGMPintheplasma

【Abstract】ObjectiveToobjectivetheeffectsofYouLvKangonthecAMP、cGMPintheplasmaofmodelingratsfollowingrenalyindeficiencyandonthebehavioroftheseanimalsandtoxicityRatsweredividedintosevengroupsrandomly:control,model,LiuWeiDiHuangWan,fiuoxetine,thelow、middleandhigh-dosegroupofYouLvestablishthemodelingratsfollowingrenalyindeficiencybyexposingtheanimalstochronicstressdepressionandgivingthemintragastricobservethebehaviorchangsintheopen-fieldtestandfluidcomsumptiontest.theplasmasamplesofexperimentalratsweretakenforcAMPandcGMPdeterminationbycomputemaximallytolerateddoseofratsbyacutetoxicitytest.ResultsAlltheindexesofthemodelratsintheopen-fieldtestandfluidcomsumptiontestweresignificantlydecreased,theplasmaconcentrationofcAMPwassignificantlyelevated;YouLvKangcanpartlyimprovethebehavioroftherats,theplasmaofcAMPweresignificantlydecreasedintheLiuWeiDiHuangWanandYouLvKangmaximallytolerateddoseofmousewere360g/kgeveryday,equivaent300timesofclinicdoses.ConclusionOneofthemechanismofincreasingyinandimprovingdepressionwastheeffectsofTheYouLvKangonthebehaviorchangsoftheratsandonadjustingthebalancebetweenthecAMPandmarginofdrugisbigger,whichsuggestthedrugissafeinclinic.

【Keywords】YouLvKang;renalyindeficiency;depression;cAMP;cGMP;acutetoxicitytest

抑郁症是一种包括精神症状和躯体症状的复杂的情感性精神障碍，属中医“郁病”范畴，肾阴虚证是郁病证型之一，由于长期情志不畅，以致耗伤阴精，髓海不充所致，尤多见于疾病中、后期及老年人群〖1〗。近年来虽然单就抑郁症以及肝肾阴虚证的研究较多，但将它们联系在一起进行实验室研究却少有报道。本文通过采用慢性轻度不可预见性的应激模型+甲状腺素的方法，造成大鼠抑郁阴虚状态，观察临床用于治疗抑郁症有良好疗效的忧虑康药〖2〗对肾阴虚抑郁模型大鼠行为学及血浆cAMP、cGMP的影响，初步探讨该药滋肾阴抗抑郁的作用机制。

1材料与方法

材料

动物健康SD大鼠，雌雄各半，体重170～190g。昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22g。

药物及试剂忧虑康药临床用量为每天80g，按处方称取药材，水煎2次,过滤，合并滤液,浓缩成相应浓度，4℃保存备用；六味地黄丸；盐酸氟西汀胶囊；甲状腺素片；环腺苷酸、环鸟苷酸。

仪器敞箱：由不透明材料制成，底面为100cm×100cm的正方形，被等分为25个等边方格，高50cm；放射免疫计数器；电子天平；低温大容量高速离心机；秒表；止血钳；恒温烘箱等。

方法

动物分组试验前，进行敞箱试验和液体消耗试验，根据敞箱试验和液体消耗试验的结果筛选大鼠，共56只，随机分为7组：空白对照组、模型对照组、盐酸氟西汀组、六味地黄丸组、忧虑康液低剂量组、忧虑康液中剂量组、忧虑康液高剂量组，每组8只。

肾阴虚抑郁模型的建立及给药根据文献〖3，4〗略有改进，采用灌胃甲状腺素合并慢性轻度不可预见性应激法，建立“肾阴虚抑郁病证”复合模型。造模方法：将4℃冰水游泳5min，禁食禁水24h，夹尾1min，明暗颠倒24h，陌生物品，潮湿垫料、鼠笼倾，40℃高温环境，电击足底。共8种刺激随机安排在21日中，每日1种，使大鼠不能预料刺激发生，以避免产生适应性。同时，每日灌胃甲状腺素/，造成大鼠抑郁+肾阴虚状态。各组从实验第7日起，氟西汀组给予盐酸氟西汀/kg；地黄丸组给予六味地黄/kg；忧虑康低、中、高剂量分别给予忧虑康液/kg、/kg、/kg；空白组与模型组均灌胃等容量蒸馏水。各组灌胃容量均为10ml/kg，每日1次，连续给药14天。除空白组外均单笼饲养。

观察模型动物一般状态及体重变化实验过程中观察大鼠外表、性情、活动情况、饮水量、大便情况，每周测1次体重。

液体消耗试验〖4〗试验前，在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24h，两瓶均装有1％蔗糖水，随后的24h，1个瓶装1％蔗糖水，1个瓶装纯水。23h禁食禁水后，进行动物的基础糖水／纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶1％蔗糖水，1瓶纯水。60min后，取走2瓶并称重。计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱。每周进行1次液体消耗试验。

敞箱试验〖5〗安静的房间内进行此项试验观察。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠在5min内中央格停留时间、穿越格数、后肢直立次数、清洁运动记数、粪便粒数。彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。每只观察1次。每周进行1次敞箱试验。

血浆cAMP、cGMP的测定实验第22天，所有动物，断头采血，取血1～2ml，注入含EDTA·Na250μ1的试管中，摇匀放入冰浴中，1h内，4℃离心2000rpm离心10min，置于-15℃～-20℃保存，用于测定。测定时严格按试剂盒说明进行操作。

急性毒性试验

预试昆明小鼠6只，以忧虑康3g生药/ml的流浸膏可供灌胃的最大浓度，小鼠可耐受的最大体积一次性灌胃给药，灌胃前禁食不禁水12h，给药后正常饲养，连续观察7天。实验结果，在给药当天小鼠活动、精神状态、饮食均正常，一周内未见死亡及其他异常现象，处死后主要脏器未发现任何异常改变。因此，无法测出忧虑康液复方制剂的半数致死量，故改做小鼠最大给药量试验。

MTD〖6～7〗取昆明小鼠40只，按性别与体重随机分为两组：即对照组和给药组。给药组以忧虑康可供灌胃的最大浓度、小鼠可耐受的最大体积，1日3次连续灌胃给药，每次间隔5h，灌胃前禁食不禁水12h；对照组灌胃等容量饮用水。两组小鼠给药后正常饲养，连续观察7天。给药前和给药后第4天、第7天测小鼠体重，观察小鼠给药后的反应、饮食、活动情况及动物死亡数。实验结束时，将全部小鼠处死，解剖，肉眼观察主要脏器的情况，计算小鼠的最大耐受量。

统计学分析SPSSFORWindows统计软件包作为统计工具，计量资料用表示，方差齐者用单因素方差分析，方差不齐的采用Tamhan分析。

2结果

各组大鼠体重及行为学指标的比较

应激前各组大鼠体重及行为学指标的比较经过筛选分组后，实验前各组动物的体重、敞箱试验得分和液体消耗试验的各项指标相近，没有统计学差异。见表1。表1应激前各组大鼠体重及行为学指标的比较注:

治疗前各组大鼠体重及行为学指标的比较治疗前与空白组相比，各组体重、敞箱试验和液体消耗试验各项指标都有下降。敞箱试验中，低剂量组水平得分及各组垂直得分均显着下降。液体消耗试验中，各组糖水偏爱%均低于空白组，其中忧虑康低剂量组、高剂量组糖水偏爱%降低有统计学意义，提示各组动物均出现不同程度的抑郁。见表2。表2治疗前各组大鼠体重及行为学指标的比较注：与空白组比较，*P＜，**P＜

治疗后各组大鼠体重及行为学指标的比较治疗14天，与空白组比较，模型组体重、敞箱试验和液体消耗试验各项指标差异均有显着性，提示抑郁模型复制成功；与模型组比较，氟西汀组在各项指标上差异均有显着性，忧虑康高剂量水平得分及忧虑康低、中、高剂量组中央格停留时间显着减少；与氟西汀阳性对照组比较忧虑康各剂量组各指标无统计学差异，说明忧虑康能部分改善模型动物的抑郁行为。见表3。表3治疗14天各组大鼠体重及行为学指标的比较注：与空白组比较，*P＜，**P＜；与模型组比较，#P＜，##P＜

忧虑康液对模型动物血浆cAMP、cGMP的影响与空白组比较，模型组血浆cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高差异有显着性，提示大鼠存在内在的肾阴虚；与模型组比较，地黄丸组、忧虑康低、中、高剂量组都有下降趋势，其中地黄丸组、忧虑康中剂量、高剂量组下降有统计学意义。见表4。表4忧虑康液对肝肾阴虚抑郁模型大鼠血浆cAMP、cGMP影响注：与空白组比较：*P＜，**P＜；与模型组比较#P＜，##P＜

急性毒性试验对小鼠灌服忧虑康药进行预试，无法测出忧虑康液的LD50，提示该中药复方制剂药是安全的；改做最大耐受量试验。灌服忧虑康药7天内各小鼠饮食、活动正常，体重增加，毛发光泽，无一例死亡。小鼠灌服忧虑康药1日内的最大耐受量为360g/kg，相当于人临床用量的300倍。

3讨论

前期实验〖8〗证明慢性不可预见性温和应激+甲状腺素是肾阴虚抑郁症实验研究的动物模型之一，因此本文复制慢性不可预见性温和应激+甲状腺素方法造模。实验中所采用的敞箱试验得分、糖水消耗量、体重变化是经典的反应动物抑郁行为学及躯体症状的指标，也是最常用的观察方法。其中体重是反映机体状况的最直观的指标；液体消耗试验中糖水消耗量、糖水偏爱百分比作为测量动物模型快感缺乏的有效客观指标，表现了对奖赏的低敏感，模拟了体验愉快的无能，也反应了内源性抑郁症的中心症状即快感缺失；敞箱试验中的水平运动得分、垂直运动得分、中央格停留时间和清洁动作次数作为测量动物模型运动、探索行为能力和兴趣、自我关注能力的客观指标〖9〗。本实验可见，模型组与空白组比较，体重、敞箱试验和液体消耗试验各项指标差异均有显着性，提示抑郁模型复制成功。从敞箱试验来看，与模型组比较，虽然忧虑康药组差异无显着性，但用药14天能部分缓解模型动物的抑郁行为，差异无显着性可能是由于治疗时间较短。忧虑康药与抗抑郁西药盐酸氟西汀，在改善动物行为及躯体症状方面作用相近；与传统补肾阴药六味地黄丸在改善动物的一般状态、增加应激抑郁大鼠的体重以及降低其血浆cAMP含量方面也相近，显示出其滋补肾阴之功。说明忧虑康药既有一定的抗抑郁作用，也有一定的滋肾阴作用，且呈量效关系。忧虑康药影响大鼠行为学和调整血浆cAMP、cGMP含量平衡，可能正是该方滋阴解郁作用机制之一，其相关研究还有待继续。本研究结果还证实，忧虑康药是安全范围较大的药物，提示忧虑康药用于临床是安全