表达载体之原核VS真核

表达载体之原核VS真核万佩原核表达体系与真核表达体系，亦如阴阳，相辅相成都是我们表达重组基因蛋白的重要载体，也各有优劣原核真核【表达】表达载体目的基因重组载体表达菌株“基因——载体——菌株——培养”培养，诱导构建转化【原核】常见启动子

λpL启动子： 热诱导启动子trp启动子： 化学诱导启动子trc启动子： trp+lac杂交启动子tac启动子： trp+lacUV5杂交启动子；

pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）T7/T7lac启动子： pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）T7启动子T7lac启动子N端融合： 易于构建。终止密码子来自载体/基因

表达量高

提前终止会干扰纯化

二级翻译起始不影响纯化C端融合： 构建时注意避免移码

基因不能自带终止密码子

提前终止不影响纯化

二级翻译起始会干扰纯化His·Tag pET系统GST·Tag pGEX系统MBP·Tag pMal系统系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统常用融合标签考虑因素细胞特性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶

多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21

T7启动子需要能够提供T7RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：

pET-28a+OrigamiB(DE3) No！

pET-21b+OrigamiB(DE3) Yes！严谨调控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密码子Rosetta系列溶解性Origami系列稀有密码子不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA无法正常在E.coli里表达，是为“稀有”密码子。表达菌株菌株适合启动子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)

Transetta(DE3)

T7/T7lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)

TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxin

reductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）PageDown表达菌株选择葡萄糖： 抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控

无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！温度： 影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG浓度： 影响表达速率、蛋白可溶性与活性

lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖 的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta其他因素： 菌体密度

Mg2+

培养体积与通气

……表达条件优化表达定位溶解性信号肽活性免疫原性产量纯化难度胞内表达可溶/包涵体不需要有/无有最高≤50%蛋白种类多，需裂解菌体，复杂周质表达多为可溶需要有有较少≤4%蛋白种类少，需渗透压休克，相对容易胞外分泌完全可溶需要有有变化较大纯化简单。但机理不详，成功先例少表面展示融合膜蛋白/嵌合于膜上需要-有-适用于疫苗开发、抗体制备，前景广阔。表达结果验证无表达或表达量低蛋白不可溶蛋白纯化障碍表达常见问题载体-菌株搭配不当，摸索最佳的组合考察稀有密码子毒基因影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）表达量低或无 表达应对：严谨调控启动子，抑制本底表达载体启动子菌株pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysSRosetta(DE3)OrigamiB(DE3)pEASYT7lac同上影响：翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达应对：在宿主中补充稀有密码子的tRNA

Rosetta系列菌株（Novagen公司）选择特殊的载体pETcoco选择特定的宿主菌BL21(DE3)pLysSBL21(DE3)pLysE优化培养条件诱导表达条件

包涵体表达【真核】酵母丝状真菌昆虫哺乳动物细胞转基因动物植物反应器遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍）增殖快（90min/代），培养容易，产量较高易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等可以进行转录和翻译后修饰加工提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，

制品免疫原性差，接种剂量大酵母表达系统（一）酿酒酵母表达系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母糖基化系统1、酿酒酵母启动子UASURSTATA起始位点编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列DAS1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：

甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH酿酒酵母表达系统常用启动子2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、GAL1、GAL7和

GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterGAL10酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：

性结合因子：MF-α

酸性磷酸酯酶：PHO5

蔗糖酶：SUC2

杀手毒素因子：KIL2、酿酒酵母分泌系统*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：

酿酒酵母信号肽特点正电荷区疏水区极性区Met目的蛋白信号肽剪切位点*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成

MF-α信号肽Met目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13编码的二肽酶糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化

3、酿酒酵母糖基化系统*过糖基化（超糖基化修饰）：

N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成

O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团酿酒酵母糖基化特点1）表达水平普遍不高

A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）

B、所采用的强启动子调控不严谨

C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2）分泌表达产物过糖基化4、酿酒酵母表达系统的缺陷（二）甲醇酵母表达系统甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母表达系统的应用甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母表达系统的优缺点1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母（methylotrophicyeast)

指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。

毕赤酵母（Pichia

pastoris)

汉森酵母（Hansenula

ploymorpha)

假丝酵母（Candiaboidinii)

1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上

B、名称和拷贝数不同毕赤酵母/假丝酵母汉森酵母

醇氧化酶

甲醇氧化酶alcoholoxidase,AOX

methanoloxidase,MOXAOX1、AOX2MOX1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子AOX1与AOX2*毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因AOX1、AOX2*AOX1与AOX2基因97%同源*AOX1占主导地位，负责AOX99%以上活性1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的真核启动子B、严谨调控型启动子AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导

2、甲醇酵母表达系统的优缺点A、表达水平高（最高水平的系统）B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150个甘露糖）D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统）E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。F、实验室和工业操作简单G、不能满足结构要求严格的糖基化

3、甲醇酵母表达系统操作原理宿主株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达甲醇酵母系统宿主二大宿主系统主要特点项目毕赤酵母汉森酵母最适温度30℃37℃最适pH值4.54.5甘油阻遏是否糖基化部分过度较正常高密度发酵100g/L100g/L

二大宿主系统主要选择标记宿主

选择标记毕赤酵母

his4、G418、Zeocin、Cu++汉森酵母leu2、his3、ura3、G418甲醇酵母系统宿主毕赤酵母系统主要宿主株宿主株

特点Y11430