DEN联合NMOR诱导建立具有转移潜能的肝癌模型

DEN联合NMOR诱导建立具有转移潜能的肝癌模型【摘要】目的探讨二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)联合N亚硝基吗啉(Nnitrosomorpholine，NMOR)诱导建立具有转移潜能的SD大鼠肝癌模型以及合适的剂量和周期。方法5周龄雄性SD大鼠110只，分成4组：DEN+NMOR组(60只)、DEN组(20只)、NMOR组(20只)以及正常对照组(10只)。第1天DEN+NMOR组和DEN组大鼠按100mg/kg腹腔注射DEN1次，NMOR组和对照组给予等量的生理盐水腹腔注射。第2天DEN+NMOR组和NMOR组给予含质量分数为1×10-4NMOR的饮水自由饮用，DEN组和对照组饮用灭菌自来水。实验共进行20周。结果16周时DEN+NMOR组、DEN组、NMOR组及正常对照组肝癌发生率分别为60%(6/10)、20%(1/5)、0(0/5)、0(0/2)；20周时分别为88%(21/24)、17%(1/6)、14%(1/7)、0(0/2)。DEN+NMOR组16周及20周肝癌肺转移率分别为33%(2/6)和48%(10/21)，其他组未发现肺转移。结论(1)用DEN启动，NMOR促进的方法诱导建立SD大鼠肝癌模型操作简便、效果确切、成瘤周期短，有一定的肺转移率。(2)按100mg/kg给予1次DEN腹腔注射，给予含质量分数为1×10-4NMOR的饮水连续20周可能是有效的剂量和周期。

【关键词】N亚硝基吗啉；肺转移；肝肿瘤；SD大鼠

【Abstract】ObjectiveToestablishdiethylnitrosamine(DEN)andNnitrosomorpholine(NMOR)inducedmetastatichepatocellularcarcinoma(HCC)modelinSDratsandinvestigateproperdoseandtreatmentperiod.MethodsOnehundredandten5weekoldmaleSDratswererandomlydividedintoDEN+NMORgroup(n=60),DENgroup(n=20),NMORgroup(n=20)andcontrolgroup(n=10).RatsinDEN+NMORgroupandDENgroupweregivenasingleintraperitonealinjectionofDENat100mg/kg,andratsinNMORgroupandcontrolgroupwereintraperitoneallyinjectedwithnormalsalineatthesamedosageatthefirstday.Fromtheseconddayon,groupsDEN+NMOR,NMORweregiven1×10-4NMORinthedrinkingwater,whileDENgroupandcontrolgroupweregivensterilizedwaterfor20weeks.ResultsTheHCCincidenceingroupsDEN+NMOR,DEN,NMORandcontrolgroupwas60%(6/10),20%(1/5),0(0/5),0(0/2)bytheendofthe16thweek,and88%(21/24),17%(1/6),14%(1/7),0(0/2)bytheendofthe20thweek.LungmetastasisincidenceingroupDEN+NMORbytheendofthe16thand20thweekwas33%(2/6),48%(10/21),respectively.NolungmetastasiswasobservedingroupsDEN,NMOR,andcontrolgroup.Conclusions(1)EstablishmentofhepatocarcinogenesismodelinducedbyDENandNMORinSDratprovidesanefficientmeansforrapidinductionoflungmetastasisofHCC.(2)AsingleintraperitonealinjectionofDENasaninitiatorofhepatocarcinogenesisatadoseof100mg/kgandfollowedby1×10-4NMORinthedrinkingwaterfor20weeksareappropriate.

【Keywords】Nnitrosomorpholine;Lungmetastasis;Liverneoplasm;SDrat

诱导性大鼠肝癌模型是肝癌研究中应用广泛的动物模型，最常用的诱导药物为二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)。但DEN诱导的肝癌多为EdmondsonⅠ级和Ⅱ级，转移率很低，与人肝癌易转移复发的情况不甚符合［1］。因此我们探讨用DEN联合N亚硝基吗啉(Nnitrosomorpholine,NMOR)诱导建立具有转移潜能的SD大鼠肝癌模型。

1材料与方法

诱癌剂

DEN，分子式(C2H5)2NNO；NMOR，分子式C4H8N2O2。均购自Sigma公司。

实验动物及分组

5周龄雄性SD大鼠110只，体质量(±)g，由安徽医科大学实验动物中心提供。分成4组：DEN+NMOR组(60只)，DEN组(20只)，NMOR组(20只)，正常对照组(10只)。饲养于该中心SPF环境下，灭菌饲料和饮用水由该实验中心提供，稳定饲养1周后，开始诱癌处理。

诱癌方法

参照文献［2］及我们预实验的结果，第1天DEN+NMOR组和DEN组按100mg/kg腹腔注射DEN1次，NMOR组和对照组给予等量的生理盐水。第2天DEN+NMOR组和NMOR组给予含质量分数为1×10-4NMOR的饮水自由饮用，DEN组和对照组饮用灭菌自来水。实验共进行20周。分别于第4、8、12周取DEN+NMOR组大鼠2～3只、其他组1～2只处死观察。剩余的大鼠于16周和20周分两批处死。实验中死亡的大鼠随时解剖观察。

观察指标

(1)一般情况：观察动物的精神、饮食、活动等情况，定期称体质量。(2)组织学检查：摘取肝脏、肺用10%甲醛固定24h后以层厚1mm大体切片观察有无肿瘤结节或转移灶。无癌灶者，取肝、肺组织；有癌灶者取癌结节及距癌灶边缘cm的组织。苏木精伊红染色镜检，肝细胞癌按Edmondson分级法分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。

统计学分析

采用SPSS统计软件，体质量采用±s表示，检验用方差分析；统计肝癌发生率、肺转移率、大鼠病死率采用χ2检验及Fisher确切概率法。

2结果

大鼠一般情况

诱癌第1周内，DEN+NMOR组和DEN组部分动物出现活动减少、饮食差，有大鼠死亡；第2周最为严重；前3周是死亡发生的高峰期；4周后大鼠情况好转，体质量增加，死亡数量明显减少；5～12周时，各组情况良好，体质量增长较快；14周以后DEN+NMOR组大鼠体质量增加较其他组减慢；20周3组体质量比较差异有统计学意义(F=34499，)。DEN+NMOR组、DEN组、NMOR组及对照组大鼠16周病死率分别为28%(17/60)、25%(5/20)、15%(3/20)、0(0/10)，20周病死率分别为30%(18/60)、25%(5/20)、20%(4/20)、0(0/10)，DEN+NMOR、DEN、NMOR3组比较差异无统计学意义(χ2=，)。

肝癌发生率及肝脏病理变化

16周和20周时各组肝癌发生率见表1。早期(4～8周)主要病理改变为肝细胞变性、坏死。16周时，DEN+NMOR组部分肝脏表面可见灰白色结节，一般为1～2个，直径为～cm；20周时，大鼠肝脏多肿大，表面粗糙，质地脆弱，呈典型结节性肝硬化表现。癌结节增大、增多，散在、多发，直径为～cm。镜下肝脏呈结节性肝硬化、肝癌表现。癌细胞多排列实片状及腺样，可见静脉癌栓(图1)。在DEN+NMOR组27只成癌动物中，25只为肝细胞癌，2只为混合性肝癌。肿瘤分化以中、低分化为主，其中Ⅰ级4只，Ⅱ级9只，Ⅲ级12只。表1肝癌发生率及肺转移率

肺转移

DEN+NMOR组发生肝癌的大鼠中，肺转移率在16周和20周时分别为33%(2/6)、48%(10/21)(表1)。肺表面出现灰白色结节，部分有融合。病理检查为肝癌肺转移并可见血管内癌栓(图2)。

3讨论

诱发性肝癌模型的建立多采用氨基偶氮染料、芳香胺类化合物、亚硝胺及黄曲霉素等化学药物，其中以亚硝胺类，尤其是DEN是公认可靠的诱癌药物。NMOR属于亚硝胺类，用DEN+NMOR诱导建立F344大鼠肝癌模型，发现肝癌发生率和肝癌肺转移率均较高，而且如果剂量合适，可以明显减少大鼠的病死率［2］。国内普遍使用的是SD或Wistar等封闭群大鼠。本实验提示，用DEN+NMOR联合诱导建立具有转移潜能的SD大鼠肝癌模型是可行的。虽然Yoshino等［2］使用DEN100mg/kg，然后给予含质量分数为4×10-5NMOR饮水建立F344大鼠肝癌模型，20周时肝癌发生率达到100%。但我们预实验时在SD大鼠上使用质量分数为4×10-5NMOR却只得到很低的诱癌成功率，原因可能是SD大鼠对肿瘤的易感性低于F344大鼠。改用质量分数为1×10-4NMOR后，效果较好。是否还可以加大剂量或延长实验周期来获得更好的效果，尚需进一步研究。

大鼠死亡时间分布多在实验开始4周内，死亡的原因主要有肺部感染、急性肝损害、肠坏死等。

前4周主要是变性，8周后可看到增生反应，出现嗜酸性、嗜碱性结节，而这些现象被认为是肝癌发生过程中的几种关键变化［3-5］。16周时出现肉眼可见的癌结节，20周时肝脏呈现典型的结节性肝硬化，癌结节散在、多发。近一半的肝癌大鼠发生肺转移。此过程与我国人肝癌多经历肝炎→肝硬化→肝癌发生、发展→侵袭转移的病理过程相类似。DEN+NMOR组肝癌发生率高于单用DEN或NMOR组，分级多为Ⅱ、Ⅲ级，有静脉癌栓和肺转移灶。这说明DEN+NMOR诱发肝癌效果肯定，癌分化程度较低，有一定的侵袭性和转移能力。

本实验表明，用DEN+NMOR联合诱导建立SD大鼠肝癌模型，操作简便、成瘤周期较短，有一定的肺转移率；病理过程遵循损伤、增生、硬化和肝癌发生、发展与转移的规律，可为研究肝癌的机制以及干预治疗提供平台。

【参考文献】

［1］陈华,赵德明.肝癌动物模型.实验动物科学与管理,2005,22(4):32-35.

［2］YoshinoH,FutakuchiM,ChoYM,etal.ModificationofaninvivolungmetastasismodelofhepatocellularcarcinomabylowdoseNnitrosomorpholineanddiethylnitrosa