地中海贫血的研究进展

地中海贫血诊断(zhěnduàn)和治疗的进展中山大学附属(fùshǔ)第二医院儿科李文益第一页，共五十八页。精选ppt

发病率(含杂合子(hézǐ))：

●全世界约1.5亿人携带血红蛋白病基因

全国：异常血红蛋白0.33%α-地贫2.64%β-地贫0.66%

广东：α-地贫7.3%(9.64%)β-地贫1.83～3.36%(3.54%)

广西：α-地贫14.9%●继发性α-地贫

第二页，共五十八页。精选ppt

遗传学

·

α珠蛋白基因簇位于(wèiyú)16号染色体上

·

β珠蛋白基因簇位于11号染色体上第三页，共五十八页。精选ppt

IVSI

IVSⅡ

16号染色体5’

3’

13132991001415’3’ζФζФα1α2α1

Kb0102030

第四页，共五十八页。精选ppt

IVSⅠIVSⅡ

11号染色体5’3’

13031104105146

5’

3’ψβ2εGγAγψβ1δβkb0102030405060

第五页，共五十八页。精选ppt缺失(quēshī)型α-地贫◆全世界缺失型已达31种◆其中－α4.2(左侧(zuǒcè)缺失)和－α3.7(右侧缺失)缺失型是遍布全世界的类型，其余突变则随地理和人群分布的不同而异。◆在我国，除上述二种缺失外，尚有－SEA(缺失20kb)、THAI(缺失31kb)、FIL(缺失30～34kb)和－α2.7等。第六页，共五十八页。精选ppt

非缺失型α-地贫◆目前已报道42种◆包括启动子突变、剪接点突变、移码突变、无义突变、终止密码子突变、核苷酸信号位点改变等◆中国(zhōnɡɡuó)人非缺失型：HbCS终止密码子突变α2TAA→CAAHbQOα2CD125(Lcu→Pro)◆其他：HbDuan，Hbwestmead,HbHekinan,HbH-CD30,HbH-CD31,HbH-CD59

第七页，共五十八页。精选ppt获得性α-地中海贫血(pínxuè)●继发于恶性(èxìng)血液病/MDS●机制：◆acquireddeletionofthe-globingeneclusterlimitedtotheneoplasticclone◆morecommonly,inactivatingsomaticmutationsofthetrans-actingchromatin-associatedfactorATRX,whichcausedramaticdown-regulationof-globingeneexpression.第八页，共五十八页。精选ppt

β-地贫◆以点突变为主，少数为缺失所致(suǒzhì)◆全世界报告突变类型>170，中国28种◆中国常见类型：(9省区检测资料)CD41-42(41.6%)、IVS-Ⅱ-654(21.8%)CD17(18.0%)、TATA-nt-28(8.0%)CD71/72(+A)(3.9%)、TATA-29(1.2%)CD26(HbE)第九页，共五十八页。精选ppt诊断(zhěnduàn)※临床表现★β地贫：◆轻型常无临床症状或轻微贫血。◆重型(zhòngxíng)患者在婴儿期出现慢性进行性贫血、轻度黄疸（间歇性）、肝脾肿大；常有发育不良和骨骼改变，出现地中海贫血面容。◆中间型多在幼儿期出现贫血，其症状比重型轻。第十页，共五十八页。精选ppt★α地贫：◆静止型无临床症状，◆轻型常无临床症状或轻微贫血。◆中间型（HbH）多在幼儿期或以后出现贫血、黄疸、肝脾肿大；感染常使贫血加重甚至出现溶血危象。◆重型多出现死胎(sǐtāi)或胎儿水肿综合征。第十一页，共五十八页。精选ppt※实验室检查★血象：贫血为小细胞低色素性，MCV＜80fl，MCH＜28pg，MCHC＜32%。网织红细胞正常或增高(zēnggāo)。外周血细胞涂片染色示红细胞大小不等，中央浅染色区扩大，出现异型、靶形、碎片红细胞和有核红细胞、点彩红细胞、嗜多染性红细胞、豪-周小体等。第十二页，共五十八页。精选ppt★地贫筛查：

◆地贫5项：①溶血度（脆性），正常值：＞60%；②HbF；③Hb电泳：HbA2,HbH；④红细胞形态（参见(cānjiàn)上）；⑤ZPP，以排除缺铁性贫血◆地贫6项：：①溶血度（脆性）；②Hb电泳；③HbF；④HbA2；⑤MHb；⑥G6PD活性。第十三页，共五十八页。精选ppt

※α-地贫的基因诊断(zhěnduàn)★缺失型：◆

Southern印迹杂交—限制性酶谱分析法：

主要用于较大片段缺失◆PCR法：

▲跨越断裂点的PCR扩增法(gap-PCR)：

可诊断、区分α地贫1纯合子和杂合子▲由gap-PCR衍生的多重PCR：一次PCR扩增能够明确缺失突变形成的各种α地贫基因型或临床类型。第十四页，共五十八页。精选ppt★非缺失型◆Southern印迹杂交诊断法◆PCR-酶解法：◆扩建酶切点法：◆PCR-ASO◆其他方法(fāngfǎ)：聚合酶链反应结合单链构象多态性分析（PCR-SSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）也曾用于α地贫点突变的基因分析，一般多用于点突变的研究而不是基因诊断和产前诊断。第十五页，共五十八页。精选ppt※β-地中海贫血的基因诊断◆PCR结合ASO探针斑点杂交技术(jìshù)◆扩增不应突变系统法（ARMS法）◆DNA芯片技术（DNAchip）◆反向点杂交（Reversedotblot,RDB）第十六页，共五十八页。精选pptβ-地贫的鉴别(jiànbié)诊断

与小细胞低色素性贫血的鉴别●缺铁性贫血●感染或炎症性贫血●肺含铁血(tiěxuè)黄素沉着症●铁粒幼红细胞性贫血●铅中毒●铜缺乏●先天性转铁蛋白缺乏症第十七页，共五十八页。精选ppt※缺铁性贫血

●多于6月~2岁发病，无家族史●不当喂养史●无溶血(rónɡxuè)证据，网织红N/↓●SI、TS、SF↓TIBC、FEP↑●骨髓内、外铁减少第十八页，共五十八页。精选ppt※慢性感染性贫血

●有感染(gǎnrǎn)、炎症史及相应临床表现

●贫血有时仅为小细胞性

●无溶血，网织红N/↓

●SI、TIBC、TS↓，SF、FEP↑

●铁粒幼细胞↓，外铁↑

第十九页，共五十八页。精选ppt※铁粒幼红细胞性贫血

●顽固贫血，铁剂治疗无效，个别(gèbié)病例母系B6治疗有效

●无溶血，网织红N/↓

●BM、外铁↑，铁粒幼红↑，可见环状铁粒幼红细胞●SI、SF、FEP↑、TIBCN/↓第二十页，共五十八页。精选ppt※肺含铁血黄素沉着症●发作性苍白，无力(wúlì)，咳嗽，痰中带血●X线胸片肺野中可见网点状阴影●痰和胃液中可找到含铁血黄素细胞●小细胞低色素性贫血，网织红↑●SI、TS↓、TIBC↑●SR↑第二十一页，共五十八页。精选ppt※铅中毒

●红细胞中可见嗜碱性点彩

●长骨(chánggǔ)X线改变

●FEP↑↑※铜缺乏性贫血

●脂溢性皮炎，皮肤毛发色素少浅表静脉扩张，自发性骨折精神障碍

●贫血、WBC↓，血铜蓝蛋白↓第二十二页，共五十八页。精选ppt※转铁蛋白缺乏症●自幼贫血(pínxuè)，1岁时贫血(pínxuè)严重●肝脾轻度大，铁剂治疗无效●网织红↓，BM内、外铁↓●SI、TIBC、TS、SF↓※其他：Coombs阴性自溶第二十三页，共五十八页。精选ppt

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地中海贫血(pínxuè)的预防

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人群普查

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遗传咨询

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产前诊断第二十四页，共五十八页。精选ppt

治疗

★红细胞输注和去铁治疗(zhìliáo)

●本疗法仍是最基本治疗方法

●高、中量输血配合铁螯合剂

●能活到成年并达到(dádào)正常人的生活能力

缺点：需终身治疗，费用昂贵易出现输血副反应，尤其是输血传染病等第二十五页，共五十八页。精选ppt红细胞输注①低量输血法：目前已不用此法

②中量输血法(moderatetransfusion)维持(wéichí)输血之前的Hb浓度＞90～105g/L

③高量输血法(hypertransfusion):维持输血前Hb＞100g/L

④超量输血法(supertransfusion)：维持输血前Hb＞120g/L第二十六页，共五十八页。精选ppt红细胞输注

●每次输浓缩红细胞10～20ml/kg,每2～4周1次●使输注后Hb浓度达130～135g/L●无论何种方法，每次输注之后Hb不能超过150g/L●浓缩红细胞输注速度(sùdù)应＜4～5ml/（kg·h）●重度贫血者输注的速度应更慢＜2ml/kg·h）第二十七页，共五十八页。精选ppt去铁治疗(zhìliáo)

铁螯合剂去铁胺(deferoxamine,DFO)过早使用（＜１岁）可产生骨骼(gǔgé)畸形、生长抑制等副作用，在规则输血１年或输红细胞10～20单位之后进行铁负荷的评估第二十八页，共五十八页。精选ppt铁负荷(fùhè)的评估方法：

①

测定血清铁蛋白(SF),简便可行，但影响因素较多；②肝穿刺后测定肝组织的铁含量，此法较准确,但属损伤性检查，一般医院难于实行(shíxíng)；③

影像学方法如MRI，此法虽简便但准确度不够且费用高如有铁超负荷，则开始使用铁螯合剂(>3.2mg/g干肝组织或血清铁蛋白＞第二十九页，共五十八页。精选pptDFO剂量(jìliàng)

●20～60mg/kg.d，每周应用5～6天●长期应用以控制铁蛋白在1000～2000μg/L之间为理想，采用连续皮下注射12小时，或持续静脉滴注8～12小时等方法(fāngfǎ)●缺点是使用较麻烦,病儿依从性差，如使用不当(铁负荷轻而用大剂量DFO）,可致白内障、听力丧失、长骨生长障碍等副作用第三十页，共五十八页。精选ppt口服(kǒufú)铁螯合剂※deferiprone(L1)●化学名羟基吡啶1，二齿状分子结构●以3:1与Fe3+结合，结合效率差些●吸收快，迅速转化成活性形式，排泄快●1984年临床实验，1995年上市(卬度)●常用量75mg/kg.d●短期疗效较差，长期疗效仍有争议(zhēngyì)●副作用：关节痛、(常见)粒细胞减少(严重)、锌缺乏、胃肠反应、肝功能异常第三十一页，共五十八页。精选ppt※ICL670●三齿状分子结构三氮唑化合物●以2:1与Fe3+结合(jiéhé)●吸收快，在血循环中存活几小时●效果为DFO的5倍，L1的10倍●剂量20mg/kg.d●副作用：胃肠反应，皮疹。肝肾功能无影响。动物实验肾小管上皮细胞有改变(非铁超负荷)第三十二页，共五十八页。精选ppt

造血干细胞移植（HSCT）●是目前(mùqián)能够根治重型β地贫的一种治疗方法●HSCT分为骨髓移植(BMT)、脐血移植(UCBT)和外周血干细胞移植（PBSCT）●胎儿期予HSCT:宫内造血干细胞移植(IUSCT)第三十三页，共五十八页。精选pptBMT治疗(zhìliáo)重型β地贫

●1982年首例成功●至今全世界应用已达1000余例●长期生存率达80％●供体来源困难，费用(fèiyong)昂贵血第三十四页，共五十八页。精选pptUCBT治疗(zhìliáo)重型β地贫

●1989年首例UCBT治疗范可尼贫血成功●1995年泰国治疗HbE／β地贫获得成功●1998年1月中山二院在内地开展首例●不少医院开展，总数已超过100例●由血缘相关发展(fāzhǎn)至无血缘相关●HLA位点由全相合发展至1～3个位点不合第三十五页，共五十八页。精选ppt异基因(jīyīn)外周血干细胞移植(Allo-PBSCT）

●1989年治疗1例慢性白血病取得成功，血细胞分离机从外周血可采到足够的造血干细胞供者无需麻醉，安全(ānquán)●PBSCT治疗地贫国外从1996年开始，香港1998报告３例，内地1999年中山二院首例，各地陆续开展第三十六页，共五十八页。精选ppt宫内造血(zàoxuè)干细胞移植

●国外于1996年开始报告(bàogào)，但至目前仅数例●国内尚未开展第三十七页，共五十八页。精选ppt基因治疗

★根治性基因治疗（基因矫正治疗）●基因矫正治疗是把正常的目的基因导入体内，并达到适当、有效、持久的表达，以完全取代原来的病态基因●β地贫是β珠蛋白基因的单基因缺陷遗传病，理论上是基因治疗最理想的模型●1984年开始基因治疗的研究，进展缓慢，其原因之一是载体问题，二是转导(zhuǎndǎo)的β珠蛋白基因片段的大小。第三十八页，共五十八页。精选ppt★β珠蛋白基因族●非常庞大，调控(diàokònɡ)也非常复杂●β珠蛋白基因组●上游基因调节元件即位点调控区(locuscontrolregion,LCR)的DNase敏感（hypersensitive,HS）片段（包括HS2、HS3、HS4）对转导后的基因表达非常重要。第三十九页，共五十八页。精选ppt★逆转录病毒载体●常用癌瘤逆转录病毒（onco-retroviralvector）携带β珠蛋白基因(jīyīn)及其调节元件●将人珠蛋白基因导入小鼠红白血病(MEL)细胞进行培养,可成功表达β珠蛋白●在小鼠动物模型上将β基因通过逆转录病毒载体转染鼠造血干细胞,在受体红细胞中获得表达。将人β珠蛋白基因导入β地中海贫血小鼠体内,其症状可获得部分改善第四十页，共五十八页。精选ppt逆转录病毒载体有如下缺点：①载体的容量有限（仅7kb左右），无法完全包含β珠蛋白基因组及其上游LCR片段(piànduàn)，因而表达效价低和不稳定；②不能转染静止期细胞；③病毒随机插入靶细胞的基因组中可使插入点附近的基因表达失控，插入的基因也有可能不恰当的表达；④病毒可能感染宿主；⑤致癌作用，动物实验已发现淋巴瘤发生。第四十一页，共五十八页。精选ppt慢病毒(bìngdú)（lentivirus）载体●优点是：①载体容量大，能包含大片段的β珠蛋白基因组及其上游调节元件，保证β珠蛋白基因的高效、稳定表达；②可以转染静止期细胞,并能永久表达。●常用的是HIV-1为基础(jīchǔ)的慢病毒载体。第四十二页，共五十八页。精选ppt2000年MayC等首次应用携带有大片段的调节序列的人的β珠蛋白基因慢病毒载体转染小鼠骨髓细胞，人的β珠蛋白基因有效、准确的整合到宿主(sùzhǔ)DNA中，并能高效表达，合成正常血红蛋白可达17-24%，达到治疗β地中海贫血小鼠的目的。文章发表在Nature第四十三页，共五十八页。精选pptPawlin等（2001）、Imrens等（2002）、Persons等（2003）、Levasceur等（2003）、Rivella等（2003）报告采用同样载体，在中间型β地贫鼠（Hbbth3/+）模型中显示每拷贝载体可使Hb增加(zēngjiā)1.1～2.3g/dl，血液参数明显纠正,红细胞形态明显好转。第四十四页，共五十八页。精选ppt●以上用的Hbbth3/+鼠为中间型鼠●为了更接近人重型β地贫，Rivella等建立了重型β地贫鼠模型。这种鼠如不治疗将在6～8周内死于严重贫血（Hb2～3g/dl）●用上述载体(zàitǐ)基因转导后则转变为中间型地贫鼠。由此提示治疗人重型β地贫时，采用这些载体(zàitǐ)转导β或γ珠蛋白基因还需要更高的表达。第四十五页，共五十八页。精选ppt位点独立性表达（positionindependentexpression）：在鼠的研究中还发现一个特征，尽管(jǐnguǎn)包含了β或γ珠蛋白基因的调节元件，但β或γ珠蛋白的表达在不同的鼠之间差异很大鸡HS4(cHS4)具染色质隔离成分（chromatininsulatorelement），在癌瘤逆转录病毒载体中已发现可减少位点作用差异（positioneffectvariegation,PEV）cHS4元件具有阻断增强子活性作用，可能有较好的载体生物安全性，对克服载体的致癌作用很重要。第四十六页，共五十八页。精选pptPuthenveetil等报告采用慢病毒载体，所包含的β珠蛋白基因族中加入cHS4染色质隔离成分,修正后的人β地贫CD34＋细胞在细胞培养中得到一致的红系分化(fēnhuà)和纠正异常的β地贫特征，移植入免疫缺陷鼠后，3～4个月后仍是红系正常分化(fēnhuà)。第四十七页，共五十八页。精选ppt基因(jīyīn)调控治疗

●是广义的基因治疗●机理是根据β地贫的病理生理基础是α链和非α链合成速率的不平衡，药物来激活(jīhuó)非α链珠蛋白基因的功能，增加非α链珠蛋白的合成速率；或抑制α珠蛋白基因功能，降低α珠蛋白的成速率的合成速率；减轻α和非α珠蛋白的失衡程度减轻临床症状第四十八页，共五十八页。精选ppt基因(jīyīn)调控治疗主要有：

①

药物基因(jīyīn)调控治疗；②

反义核酸性基因调控治疗；③

造血生长因子治疗。④中药治疗第四十九页，共五十八页。精选ppt药物基因调控治疗1982年首先(shǒuxiān)报告应用５-氮胞核苷许多药物，如羟基脲、丁酸盐、阿糖胞苷、马利兰、雷米封等都有研究报告羟基脲（HU）的研究报告最多，效果也较好第五十页，共五十八页。精选ppt羟基(qiǎngjī)脲（HU）

是抑制二磷酸核糖核苷还原酶的S期特异性细胞毒药物(yàowù)，一种相对