九组微生物的实验室培养 yong

㈠.微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）病毒、类病毒、朊病毒◆微生物的共同特点：一.微生物基础知识本文档共77页；当前第1页；编辑于星期二\9点30分1.细菌的形态球菌弧菌杆菌本文档共77页；当前第2页；编辑于星期二\9点30分二分裂2.细菌的繁殖3.细菌的菌落⑴.定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。⑵.特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。⑶.功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。为抵抗不良环境可形成细菌的休眠体——芽孢本文档共77页；当前第3页；编辑于星期二\9点30分几种菌落及其形态本文档共77页；当前第4页；编辑于星期二\9点30分几种菌落及其形态本文档共77页；当前第5页；编辑于星期二\9点30分微生物需要的五大类营养要素物质是：㈡.微生物需要的营养物质及功能1.碳源2.氮源3.生长因子4.无机盐5.水：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。①无机碳源：CO2；NaHCO3等②有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等①构成细胞物质和一些代谢产物②异养微生物的能源⑴.概念⑵.来源：⑶.作用：1.微生物的碳源本文档共77页；当前第6页；编辑于星期二\9点30分①无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。②有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。2.微生物的氮源⑴.概念：⑵.来源：⑶.作用：3.生长因子⑶.常见的生长因子：⑴.概念：⑵.作用：微生物生长不可缺少的微量有机物。（而自身不能合成）酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。本文档共77页；当前第7页；编辑于星期二\9点30分㈢.培养基1.概念：培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质。3.培养基的类型和用途2.培养基的成分：一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气等的要求。P14P15本文档共77页；当前第8页；编辑于星期二\9点30分培养基的用途液体培养基：增菌固体培养基：纯化，增菌半固体培养基：动力检测，保种本文档共77页；当前第9页；编辑于星期二\9点30分培养基的种类不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基P84本文档共77页；当前第10页；编辑于星期二\9点30分液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长back半固体培养基：(是否运动)

无动力有动力(弥散)固体培养基：菌落本文档共77页；当前第11页；编辑于星期二\9点30分选择培养基的种类本文档共77页；当前第12页；编辑于星期二\9点30分练习1.不能作为异养微生物碳源的是（）A．牛肉膏B．含碳有机物C．石油D．含碳无机物D本文档共77页；当前第13页；编辑于星期二\9点30分2.自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是（）

A．碳源B．氮源

C．无机盐D．生长因子A本文档共77页；当前第14页；编辑于星期二\9点30分3.下列关于生长因子的说法中，不正确的一项是（）

A．是微生物生长不可缺少的微量有机物

B．是微生物生长不可缺少的微量矿质元素

C．主要包括维生素、氨基酸和碱基等

D．一般是酶和核酸的组成成分B本文档共77页；当前第15页；编辑于星期二\9点30分

4.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在碳源为纤维素的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出（）①大肠杆菌②霉菌③放线菌④纤维素分解菌

A.④②

B.①②

C.①③

D.③④

解析：选A。本题考查了微生物分离知识。纤维素分解菌可以利用纤维素，大部分微生物却不能；培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌，但霉菌能够生长。本文档共77页；当前第16页；编辑于星期二\9点30分5．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是

。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

，用于培养

，

自养型微生物

含碳有机物

金黄色葡萄球菌

本文档共77页；当前第17页；编辑于星期二\9点30分（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。（4）表中营养成分共有______

类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是

。（6）右表中各成分重量确定的原则是___________________________。

（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分

。固氮微生物

3调整pH

依微生物的生长需要确定

琼脂（或凝固剂）

本文档共77页；当前第18页；编辑于星期二\9点30分1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是稀释平板涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。㈣.无菌技术本文档共77页；当前第19页；编辑于星期二\9点30分

（１）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-levelDisinfection）、中程度消毒（Intermediate-levelDisinfection）、低程度消毒（Low-levelDisinfection）三种方式。2.消毒与灭菌的概念

本文档共77页；当前第20页；编辑于星期二\9点30分

（2）灭菌的定义：

以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。

灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。本文档共77页；当前第21页；编辑于星期二\9点30分无菌技术本文档共77页；当前第22页；编辑于星期二\9点30分思考：1.获得纯净培养物的关键？2.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（P15旁栏思考）3.消毒和灭菌有何不同？4.常用的消毒和灭菌方法有哪些？

无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。防止外来杂菌的入侵（详情请见下一页）本文档共77页；当前第23页；编辑于星期二\9点30分本文档共77页；当前第24页；编辑于星期二\9点30分消毒与灭菌的比较较为温和强烈部分生活状态的微生物全部微生物不能能本文档共77页；当前第25页；编辑于星期二\9点30分①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min。③化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。④紫外线消毒。⑴.消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法本文档共77页；当前第26页；编辑于星期二\9点30分表面灭菌和空气灭菌等使用

紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。照射30min，可先喷洒石炭酸或煤酚皂溶液加强消毒效果。本文档共77页；当前第27页；编辑于星期二\9点30分（2）灭菌a

灼烧灭菌b

干热灭菌c

高压蒸汽灭菌灼烧灭菌

微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧。注意适用范围本文档共77页；当前第28页；编辑于星期二\9点30分干热灭菌160－170℃；1－2h能耐高温的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高压蒸汽灭菌100kPa121℃15-30min通常用于培养基的灭菌本文档共77页；当前第29页；编辑于星期二\9点30分

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

本文档共77页；当前第30页；编辑于星期二\9点30分请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。⑴培养细菌用的培养基与培养皿⑵玻棒、试管、烧瓶和吸管⑶实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。P16旁栏思考本文档共77页；当前第31页；编辑于星期二\9点30分即学即练1.

下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是(

)A．防止杂菌污染B．消灭杂菌C．培养基和发酵设备都必须灭菌D．灭菌必须在接种前B本文档共77页；当前第32页；编辑于星期二\9点30分本文档共77页；当前第33页；编辑于星期二\9点30分B本文档共77页；当前第34页；编辑于星期二\9点30分培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是（）①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线消毒⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法A.⑤③②①④⑥B.①②③④⑤⑥C.⑥②③④①⑤D.③④②①⑥⑤A本文档共77页；当前第35页；编辑于星期二\9点30分外科手术器械和罐头食品的处理，要以能够杀死什么为标准（）A.球菌B.杆菌C.弧菌D.芽孢D本文档共77页；当前第36页；编辑于星期二\9点30分二.实验操作(以培养大肠杆菌为例)㈠.制备牛肉膏蛋白胨培养基1.计算2.称量3.溶化4.灭菌:将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。5.倒平板:待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。本文档共77页；当前第37页；编辑于星期二\9点30分倒平板操作本文档共77页；当前第38页；编辑于星期二\9点30分答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。问题讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？本文档共77页；当前第39页；编辑于星期二\9点30分3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。本文档共77页；当前第40页；编辑于星期二\9点30分

关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，错误的是（）

A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

B.牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸

C.待培养基冷却至50℃左右时，进行倒平板

D.待平板冷却凝固约5min～10min后，将平板倒过来放置

解析：选A。本题考查了牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备过程。其顺序为：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，故A项错误。本文档共77页；当前第41页；编辑于星期二\9点30分㈡.纯化大肠杆菌平板划线法和稀释涂布平板法。微生物的接种的常用接种方法有：1.平板划线的操作方法本文档共77页；当前第42页；编辑于星期二\9点30分本文档共77页；当前第43页；编辑于星期二\9点30分答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？本文档共77页；当前第44页；编辑于星期二\9点30分2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。本文档共77页；当前第45页；编辑于星期二\9点30分答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？2.稀释涂布平板的操作方法本文档共77页；当前第46页；编辑于星期二\9点30分4.菌种的保存固体斜面培养基上4℃保存，菌种易被污染或产生变异3.微生物的恒温培养⑵.长期保存：－20℃甘油管在冷冻箱中保藏⑴.临时保藏：本文档共77页；当前第47页；编辑于星期二\9点30分三.结果分析与评价本文档共77页；当前第48页；编辑于星期二\9点30分本课题知识小结:本文档共77页；当前第49页；编辑于星期二\9点30分【典例解析】例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。D本文档共77页；当前第50页；编辑于星期二\9点30分

例2.下面对灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前B本文档共77页；当前第51页；编辑于星期二\9点30分练习1.获得纯净培养物的关键是A将用于微生物培养的器皿，接种用具和培养基等器具进行灭菌B接种纯种细菌C适宜环境条件下培养D防止外来杂菌的入侵本文档共77页；当前第52页；编辑于星期二\9点30分练习1.获得纯净培养物的关键是A将用于微生物培养的器皿，接种用具和培养基等器具进行灭菌B接种纯种细菌C适宜环境条件下培养D防止外来杂菌的入侵本文档共77页；当前第53页；编辑于星期二\9点30分练习2.下列操作与无菌技术无关的是A接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手B接种前用火焰烧灼接种针C培养在50℃左右时搁置斜面D在酒精灯的火焰旁完成本文档共77页；当前第54页；编辑于星期二\9点30分练习2.下列操作与无菌技术无关的是A接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手B接种前用火焰烧灼接种针C培养在50℃左右时搁置斜面D在酒精灯的火焰旁完成本文档共77页；当前第55页；编辑于星期二\9点30分练习3.外科手术器械和罐头食品的处理，要以能够杀死什么为标准A球菌B杆菌C螺旋菌D芽孢本文档共77页；当前第56页；编辑于星期二\9点30分练习3.外科手术器械和罐头食品的处理，要以能够杀死什么为标准A球菌B杆菌C螺旋菌D芽孢本文档共77页；当前第57页；编辑于星期二\9点30分

例1某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。（1）培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了

和

。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是

和

。（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是

。（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于

中培养，培养的温度设定氮源碳源无机盐水高压蒸汽灭菌恒温箱本文档共77页；当前第58页；编辑于星期二\9点30分在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种

作为对照进行实验。（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有

种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越

。（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐

细菌，这种培养基被称为

。无菌水多高选择培养基盐本文档共77页；当前第59页；编辑于星期二\9点30分练习2.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地,以丰富学生的劳动技术课内容,首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理,准备食用菌栽培所需的各种原料和用具,然后从菌种站购来各种食用菌菌种.请回答以下问题:本文档共77页；当前第60页；编辑于星期二\9点30分练习①对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：_________________________________其中提供氮源的主要是_______；提供能源的主要物质是_______；琼脂的作用是_______，它不提供营养。本文档共77页；当前第61页；编辑于星期二\9点30分练习①对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：_________________________________其中提供氮源的主要是_______；提供能源的主要物质是_______；琼脂的作用是_______，它不提供营养。牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂本文档共77页；当前第62页；编辑于星期二\9点30分练习①对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：_________________________________其中提供氮源的主要是_______；提供能源的主要物质是_______；琼脂的作用是_______，它不提供营养。牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂蛋白胨本文档共77页；当前第63页；编辑于星期二\9点30分练习①对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：_________________________________其中提供氮源的主要是_______；提供能源的主要物质是_______；琼脂的作用是_______，它不提供营养。牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂蛋白胨牛肉膏本文档共77页；当前第64页；编辑于星期二\9点30分练习②微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的_____,在烧杯加入琼脂后要不停地_____,防止_____________________.本文档共77页；当前第65页；编辑于星期二\9点30分练习②微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的_____,在烧杯加入琼脂后要不停地_____,防止_____________________.比例本文档共77页；当前第66页；编辑于星期二\9点30分练习②微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的_____,在烧杯加入琼脂后要不停地_____,防止_____________________.比例搅拌本文档共77页；当前第67页；编辑于星期二\9点30分练习②微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的_____,在烧杯加入琼脂后要不停地_____,防止_____________________.比例搅拌琼脂糊底引起烧杯破裂本文档共77页；当前第68页；编辑于星期二\9点30分练习③将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞后包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入___________中灭菌，压力为________，温度为______，时间__________，灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力____________，将试管取出。本文档共77页；当前第69页；编辑于星期二\9点30分练习③将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞后包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入___________中灭菌，压力为________，温度为______