蛋白质定量分析

蛋白质定量分析第一页，共二十一页，编辑于2023年，星期五定性分析定量分析有没有是不是有多少第二页，共二十一页，编辑于2023年，星期五内容BCA法测定蛋白质含量蛋白质定量分析的方法操作注意事项思考讨论第三页，共二十一页，编辑于2023年，星期五

BCA法测定蛋白质含量

2.掌握分光光度计的使用。实验目的1.掌握BCA法测定血清蛋白质浓度的原理。第四页，共二十一页，编辑于2023年，星期五BCA分子式BCA试剂盒实验原理

BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）第五页，共二十一页，编辑于2023年，星期五实验原理紫蓝色562nm第六页，共二十一页，编辑于2023年，星期五实验步骤（一）实验材料

1、器材721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管

2、试剂（1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。（2）试剂B：4%硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。（4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于

100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。（5）待测样品。第七页，共二十一页，编辑于2023年，星期五

表1BCA法测定蛋白质含量

管号试剂（mL）

空白管

1

2

3

4

5

测定管

标准蛋白溶液（0.3mg/ml）

—

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

—

蒸馏水

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

—

—

待测样品

—

—

—

—

—

—

0.5

BCA工作液

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

蛋白质含量g

30

60

90

120

150

数据有改动ug第八页，共二十一页，编辑于2023年，星期五1、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。 （二）实验操作C=MV——×250第九页，共二十一页，编辑于2023年，星期五蛋白质定量分析的方法紫外线吸收法改良微量凯式定氮法双缩脲法

Folin-酚试剂法考马斯亮蓝结合法

BCA法280nm16%第十页，共二十一页，编辑于2023年，星期五方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值强碱性缓冲液TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响第十一页，共二十一页，编辑于2023年，星期五

BCA法的特点

1、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好

3、抗试剂干扰能力较强4、经济实用第十二页，共二十一页，编辑于2023年，星期五注意事项1、实验分组2、准确量取试剂，吸管残余液体要吹出。3、平行加样，物归原位。4、正确使用分光光度计，比色杯不润洗。5、正确绘制标准曲线，标注名称、姓名、仪器型号、作图时间。6、实验结果书写规范，三线表。第十三页，共二十一页，编辑于2023年，星期五可见光分光光度计的操作步骤：1）预热仪器。2）选定波长。3）固定灵敏度档。一般固定在“1”档。4）调节“0”点。5）调节T=100％。6）测定。7）关机。（重复2-3次）第十四页，共二十一页，编辑于2023年，星期五表1BCA法测定蛋白质含量管号空白管12345测定管M（ug）306090120150？吸光值仪器型号：721/722型波长=562nm第十五页，共二十一页，编辑于2023年，星期五思考讨论1、蛋白质定量分析的多种方法中，哪种方法更适合测定血清蛋白的浓度，说出你的理由？2、实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？第十六页，共二十一页，编辑于2023年，星期五

下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

预习要点：1、复习蛋白质两性解离。2、预习电泳的基本原理。3、请简要写出操作流程图。4、请写出计算公式。第十七页，共二十一页，编辑于2023年，星期五第十八页，共二十一页，编辑于2023年，星期五

一、蛋白质的相关理论知识16%蛋白质的平均含氮量样品中蛋白质的含量=样品中氮含量÷16%（或×6.25）凯氏定氮法1、元素组成第十九页，共二十一页，编辑于2023年，星期五

2、蛋白质的紫外吸收280nm蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外线吸收法共轭双键第二十页，共二十一页，编辑于2