工程参数检控原理分析

工程参数检控原理分析2.1生物反应器过程的多尺度效应与工程学原理

2.1.1生物反应过程多尺度系统

2.1.2生物反应器中多尺度结构系统特点

2.1.3跨尺度观察与控制

2.2细胞代谢流分析为核心的发酵工程关键技术

2.3方法和装备技术研究

2.4应用与结果2.1生物反应器过程的多尺度效应与工程学原理发酵工程在国民经济发展中的作用发酵工程的新内涵──生物技术发展与产业化食品：新型食品添加剂、防腐剂、功能食品基因工程产品：新药、抗体疫苗、酶生物基化工产品：可降解塑料、1,3丙二醇、生物乙烯生物能源:纤维素乙醇、生物柴油环境保护：利用生物法治理环境污染农业发展环境：饲料、农副产品深加工、生物肥料、土壤改造、农药发酵工程产品涉及众多行业领域：轻工(食品)、医药(发酵类）化工、农业、环保、能源等技术发展中面临的主要问题存在问题：优化与放大技术效率低（10-30%），周期长（月、年）优化与放大困难：传感器提供了大量生物学信息全局动态优化与放大困难基因、转录、表达、代谢途径…温度、搅拌、pH、DO、培养基配方…

对于活体细胞调控来说，采用传统的生物学方法或化学工程的调控方法，存在很大的问题，国内外都没有很好解决。2.1.1.微生物发酵过程复杂系统多尺度参数相关分析机制与理论上万个基因，上千个代谢物和反应器的混合传递基因网络、细胞代谢网路、反应器网络（不同的空间尺度和时间尺度）不是简单的统计热力学关系网络间的多输入多输出关系──物质流、能量流、信息流生命属性所特有的时空串联反应关系不同尺度的网络状态关系参数相关分析与跨尺度测量每个尺度网络通过网络间的输入输出，形成对复杂系统总体的影响，表现在不同尺度参数相关实现发酵过程中与基因、细胞、反应器多尺度变化相关的宏观细胞代谢流和反应器物质流参数检测发酵过程海量的数据处理：软件包与模型的建立寻找过程敏感参数，通过对敏感参数的优化调整实现跨尺度的优化,找到发酵过程优化或放大关键问题发酵过程优化和放大研究中的科学问题长期来，对于微生物过程优化的研究只是停留在细胞外的反应器过程可操作因素的研究，虽然也有化学工程的学科原理，但局限性很大。随着分子生物学的发展，但是由于单一生理调控机制出发的研究往往只揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，难以对整个发酵过程优化控制和放大起决定性作用。

如何把生物学与工程学相结合，解决局部与整体、时变动态与最终结果、菌种改造与过程优化的关系。

以各自研究的技术背景从单一尺度去理解和分析研究发酵过程特点菌种选育或基因构的研究人员对分子尺度的DNA变化有深刻的理解研究各种菌种突变和筛选方法采用编码生物合成途径中关键酶基因质粒转移或改造来改良生产菌种组合生物合成：微生物的多样性和次级代谢物的多样性，以及天然资源中获得的有意义基因，通过重组、组合或互补形成高生产水平或新结构的化合物的多酶体系基因工程构建：综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面因素，以及表达载体，宿主系统特性等细胞代谢特性研究细胞形态学细胞生理学代谢途经：以代谢调控为核心的外部环境条件控制缺乏主动性和目标性，很大部分还停留在经验摸索水平上代谢工程：采用基因工程重组技术对细胞酶、运输和调节功能进行处理来改善细胞代谢途经的技术。扩展细胞代谢途经，得到新的代谢物。强化瓶颈部分的代谢流，达到提高菌株或细胞株的生产水平工程化研究操作变量优化：通气、搅拌、补油方式、补料方式状态变量优化：温度、DO、pH、溶解CO、氧化还原电位……设备设计：通气比、搅拌功率、H/D、d/D、搅拌桨形式、装料系数、总空气管距离、灭菌方式……化学工程三传（动量、质量、热量）问题研究，放大技术（无因次、时间常数、数学模拟、经验法则）计算流体力学研究

空间尺度与时间尺度

基因水平的分子尺度属于纳尺度范围，一般在10-9M以下细胞尺度属于微尺度范围，在10-8-10-4M之间反应器尺度属于介尺度范围，在10-3-102M之间

-6-4-20246[s]logtime酶浓度变化质量作用变构控制m-RNA控制种群选择进化微生物和细胞在酶活性水平上（包括酶的激活、抑制、亚基的结合和解离、共价修饰和降解）控制的时间常数描述在ms至s的范围内基因表达调控水平上（诱导、阻遏）描述至min细胞内酶的浓度变化与菌体生长由小时至天为单位种群选择和进化水平上则描述至更大的单位基因组环境组转录组蛋白组代谢组基因操作过程优化TCS调控网络转录调控网络代谢调控网络

微生物反应工程尺度划分根据不同的研究要求和相关的学科发展，可以有不同的划分以细胞过程为研究对象：分子层次尺度、分子聚集体尺度、细胞细微结构尺度和细胞尺度上进行多尺度系统研究。生物反应器的混和传递特性研究：可以将系统分解为单颗粒的微尺度、团聚物的介尺度和设备的宏尺度。揭示生命过程基因信息传递规律：可以使用量子化学的方法从电子和原子核到DNA生物大分子这一尺度跨越研究2.2

生物反应器中多尺度结构系统特点复杂系统多尺度结构的普遍性

“多尺度”的提法最早出现在化学工程学科领域

以“单元操作”和“过程传递”为标志的传统方法已不能满足这一需求，研究流动、传递、分相和反应（范围小至分子，大至河流、大气）多尺度行为和同一尺度下这些现象共存的规律，是当前化学工程定量化的趋势。

时空多尺度特征是过程工程中所有复杂现象的共同特征。对物质转化系统进行研究时，如果以某一物质现象的不同尺度作为对象，一旦找出可遵偱的关系，就可能从现象到本质，过程研究与控制将发生质的变化。

复杂系统多尺度结构的普遍性

尺度的因素不仅存在于化工中，美国1999-04-02出版的Science是复杂科学问题的专刊，

“多尺度”的术语已经被广泛地使用，但不同人所认同的“尺度”的含义可能不相同，往往是每一种尺度的划分及其尺度间的相关特性都有其某一学科发展的背景。

活细胞为主体生物反应器过程的尺度划分作为工业过程研究，应抓住多尺度系统的结构、性能和制备的关系

可以分为基因分子水平的网络结构、细胞水平的代谢网络与生物反应器系统的宏观网络结构是不同尺度的网络状态微生物代谢流是这一网络关系的的核心问题。微生物的代谢流处于不断变化之中，其方向、流量甚至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢流的变动性和代谢网络中途径的选择性。

具有“变化着的结构”

当生物反应器尺寸或操作条件变化时，发生的结果变化不是简单的用线性关系或平均统计方法所能描述的物质状态的变化。导致过程变化的原因除了线性或动力学因素之外，往往还发生在系统结构性的突变。虽然这种结构性突变从本质上看还是动力学行为，但由于不同尺寸的边界条件难以区分，甚至还未能发现，就造成系统结果的差异或最优过程的严重偏离。

由于不同尺寸的边界条件难以区分，甚至还未能发现，就造成系统结果的差异或最优过程的严重偏离

经典的以动力学为基础的工程学概念系统结构性变化的非线性特征

动态研究与定态研究变构效应研究为例：从分子层次尺度上的应答进行研究,当一个小分子作用于变构酶的某些位点时，必然引起一系列后续变化。由快反应引发的慢过程，也就是小分子在大分子上的极快的结合引起相对慢的构象变化，有时甚至引起的构象改变通过大分子链由近及远地传到远离结合位点的地方这种在极短时间内发生的事件和极长时间内发生的事件相互关联，使快反应延伸为慢过程，时间跨度大

子尺度分析以化学工程“三传一反”为基本内容的计算流体力学。对生命过程的认识，包括各种产物的生物合成机制、代谢调控与代射工程功能基因、基因突变与重组技术、RNA调控等，都有系统而深入的研究，并且不断有新的发现。这些都为我们研究子过程提供了重要的基础，必须及时地把有关内容归纳到子尺度研究中。

跨尺度观察与操作工业规模的生物过程只能在反应器尺度上进行测量与操作可以从低一尺度层次的规律或性质，来预测研究另一尺度层次的规律或性质多尺度综合与各子过程的相互量化关系，澄清不同尺度间相互作用和耦合的原则和条件跨尺度操作是难题，分析跨尺度问题往往需要纳入跨学科和跨技术的手段

2.3细胞代谢流分析为核心的发酵工程关键技术

网络状态的互动关系

多尺度问题研究为我们研究生物反应器中提供了重要的方法和线索细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性是研究生物反应器中多尺度关联问题的有效方法

细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性生物反应器细胞生长细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性细胞生长Xm(cp)Pco2P细胞水平的代谢动力学SUROURHERH+CERPPR传统的生物反应器物料流反馈控制

必需高度重视代谢流及其对反应器的影响产物与代谢流有关不同层次反应的关联方法(IFB)葡萄糖氮源前体油rpmFH+热(MVS)SFROTRHTRH+FR反应器混和与传递常规控制器生物反应器sDO剪切TpH(EVs)(PVs)(3)数据驱动型方法复杂性多容量过程高度非线性动态性不可预测性线性或拟线性关系的数学摸型发酵生产完整过程发酵过程参数趋势曲线相关关键技术

数学模型、静态和动态优化、系统识别、自适应控制、专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究困难跨尺度观察2.4方法和装备技术研究基本方法●

基于参数相关的发酵过程多水平(尺度)问题研究的优化技术●

发酵过程多参数调整的放大技术多参数趋势曲线相关区分三个水平(尺度)问题生物反应器的传递与混和细胞代谢流的迁移不同环境条件下的代谢动力学特征基因水平的启动与表达…关键技术用于发酵过程数据优化与放大的专用装置

以生物反应器中的观点，在实验室规模发酵罐，具有十四个以上发酵过程在线参数检测或控制。在原理上与现有国内外生物反应器有重大区别。物料流检测关键技术参数检测配置示意图关键技术在2000年上海国际工业博览会上展出的FUS-50L(A)发酵罐关键技术增加了自闭环控制热质量流量计、直插式隔膜罐压传感器、不同量程范围的补料电子称、抗干扰的高精度培养液称重技术等参数检测技术；同时直接检测温度、自动保护系统、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、溶解氧浓度（DO）、发酵液真实体积（或重量）、三个补料量、排气CO2和O2等十四个在线参数，并在线精确计算得到OUR、CER、RQ、KLα、μ等重要的间接参数；配备功能强大的下位机控制软件和上位机生物过程检测软件（BIORADARTM，专利申请号：）计算机软件包；代替吨级中试发酵罐，具有更优越的发酵过程优化与放大性能。新概念发酵罐的崭新特点温度传感器、耐高温pH和溶氧（DO）传感器通气质量流量计▲压力传感器▼电子秤新传感技术

补料测量与控制系统控制系统：流速调整幅度大(从0.1ml/h-5L/h)，可变速蠕动泵，占空比可调整的开关控制。全罐电子秤称重系统新传感技术博山电机稀土电机进口电机电机底阀软件设计数据处理功能BlORADAR。在线检测参数实验室手工测定参数间接参数(代谢流特征或工程特征)适应多种反应器特点融合多种过程理论和控制理论工艺分析与操作远程通讯与异地数据传送和分析关键技术计算机控制与数据处理软件包适应多种反应器特点，融合多种过程理论和控制理论，便于发酵过程工艺分析和优化操作。工业生物过程研究方法与科学问题工业用菌种改造是高效生产的关键，又有难度，常规诱变育种、基因工程改造等往往在现有工业产菌种改造中发挥的作用有限工业生物过程更注重菌体基因变化后对生产有重大影响的表型变化，表型多态性，全局调控系统生物学研究工业生物过程中所有的基因、蛋白质、组分间的所有相互关系，是对生物的全域性（global）研究为特征

系统生物学指导的细胞生理特性研究系统生物学指导的工业生产菌株改造组学研究（x-ome)Transcriptome:(DNAoligonucleotideandcDNAmicroarrays)Proteome:(Two-dimensionalgelelectrophoresiscoupledtoMSordirectMSanalysis)Fluxome:(isotopicallylabeledsubstratescoupledtodetectionbyGC-MSMetabolome:(numerousanalyticalmethodsincludingLC-MSandGC-MS)measurementsinsilico:IndustrialbiotechnologyisbeginningtoexploitthebenefitsofthesetoolsrealizingthatmetabolicengineeringstrategiesforimprovedprocessdevelopmentmayfirstbescreenedinsilicoExperiment:high-probabilityofsuccesslistofgeneticperturbationsthatshouldbeexperimentallyvalidated.Highlyiterative:Theprocessishighlyiterative,withstrainconstructionandcharacterizationprovidingnewx-omedatathatcanbeusedtoimprovethemodels阿维菌素发酵蛋白谱

建立匹配组和比较组

其中“△”为Landmarker，“□”和“□”为手动匹配蛋白点，其余字母代表自动匹配蛋白点在对应的2-DE凝胶上进行切点、酶解、MS/MS鉴定。根据肽指纹图谱（PMF）信息，通过NCBI数据库进行搜索，共有132种蛋白被成功匹配碳水化合物运输和代谢为例差异蛋白质分析

S.avermitilis

在TSB（左）和复合培养基（右）中差异表达蛋白点（碳代谢）。“○”代表复合培养基上调蛋白点；“□”代表复合培养基中下调蛋白点amyA2编码的α淀粉酶icdA编码的异柠檬酸脱氢酶生物芯片中心SOM分析阿维菌素合成速率与基因表达生物信息处理显著性趋势分析（STC） 主流表达趋势所含基因的功能显著性分析（Stc-GO） 差异基因表达调控的动态网络——Dynamic-GeneNet基因功能的显著性分析——GO-Analysis显著性功能之间的相互作用网络—GO-Map

信号转导通路的显著性分析——PathwayAnalysis

通路间的相互作用网络分析—Path-Net信号流分析——Signal-flow

Yx/sYp/smoYp/sYx/smo恒化器(chemostat)与宏观动力学研究13C微观代谢流测试批发酵、动态生长与生产阶段中心代谢与次级代谢维生素B12发酵不同代谢途径支路代谢物的13C丰度

生物反应器流场特性与细胞生理特性相结合的过程放大技术科学问题的提出生物体与环境变化的适应性──环境组学反应器流场特性的非一致性──不可能同时做到放大时几何相似、流体远动学相似、流体动力学相似主要靠人工经验的逐级放大，周期长、效果差基因组测序组学分析构建全基因组代谢模型细胞功能模拟、预测基因靶点基因操作：基因增强基因敲除异源表达宏观代谢特性代谢流为核心的过程组学分析代谢特性的动态多尺度相关分析过程调控目标过程控制过程优化菌种改造过程性能评估恒化培养计量化学研究组学分析:微观代谢解析新代谢网络FBA生物过程研究（时变）比较基因基因注释环境特性研究细胞内生命过程高吨位发酵罐放大流场特性CFD模拟生物反应器过程研究（不均匀流场）过程放大Insilicowet高通量筛选细胞结构性能研究（静态）多轮操作多轮操作多轮操作多尺度参数相关分析基于系统生物技术的工业生物制造研究多尺度参数相关分析方法在柠檬酸发酵过程优化中的应用解除ATP、柠檬酸的抑制AMPPi激活作用NH4+丙酮酸代谢固定CO2顺乌头酸酶失活：Fe2+异柠檬酸失活:Cu2+、Fe2+2mg/L和情况下α-酮戊二酸脱氢酶的调节:高葡萄糖和NH4+阻遏柠檬酸积累的代谢调节产品1.3-二磷酸甘油酸ADPATP3磷酸甘油酸葡萄糖甘油醛-3-磷酸NADHNAD+PEP丙酮酸ADPATP乙酰CoANAD+NADH1/2O2+H+NADH呼吸链NAD+2e-H2O3ATP3ADP能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活，使葡萄糖到柠檬酸的代谢受影响。能荷的调节保证NAD+供应氧的需求对PFK的抑制原有发酵过程中的控制参数

现有生产中是很粗犷的，在培养过程中除了对温度和罐压进行控制外，其他的都处于不控制状态。（没有溶氧仪、空气流量计等），培养过程中不调控pH、不流加其他任何物质。───摘自中粮丰原生物化学公司技术报告O2、CO2、pH、无机离子、NH4、糖、氮源…菌种诱变、基因改造、途径酶活、…发酵过程全局优化？

用于柠檬酸发酵研究的实验室装置尾气分析系统—质谱仪多参数实验室柠檬酸发酵罐（包括CO2、OPR、生物量等16个传感器和控制回路）基于生物信息处理的生物过程研究宏观代谢流与微观代谢流丙酮酸代谢固定CO2跨尺度测量RQ与产物之间的关系研究RQ值动态变化与菌种改造、操作条件（操作、培养基、设备）的关系细胞内：代谢途径中的CO2固定RQ柠檬酸产物发酵罐测量参数供氧与RQ值之间的关系OUR下降，RQ上升：缺乏NAD+→CO2固定↓40%临界氧：成团菌丝内氧扩散梯度增加当DO↓→OUR↓耗氧与RQ值的关系：NAD缺乏40%临界氧：菌丝成团菌形与产量：高产表型PCO2与固定CO2的关系流场（剪切、浓度）与菌形、O2、CO2的关系：装备设计与放大不同操作条件下的参数相关特性第11批全清液发酵活细胞电容值X、干重（菌浓）、pH与OUR、CER关系第9批发酵过程温度对OUR的影响第8、9和10批发酵过程RQ等参数变化可提供的平台技术多尺度参数相关过程优化研究技术菌体细胞