第四章 营养和培养基

第四章营养和培养基兽医微生物学及免疫学课程组第一页，共六十二页，编辑于2023年，星期五培养基的概念人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合营养基质。培养基的条件任何培养基都应该具备微生物生长所需的六大营养要素合适的营养素种类合适的营养素比例培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水第二页，共六十二页，编辑于2023年，星期五培养基中应含满足微生物生长发育的：水分、碳源、氮源、生长因子以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、镁、钾和铁及各种微量元素。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。第三页，共六十二页，编辑于2023年，星期五一、选用和设计培养基的原则和方法（一）选用和设计培养基的原则1、目的明确2、营养协调3、理化条件适宜4、经济节约在微生物学的研究和生产实践中，配制合适的培养基是一项最基本的要求。第四页，共六十二页，编辑于2023年，星期五1、目的明确培养对象及产物培养目的不同，原料的选择和配比不同。培养不同的微生物应根据其特点采用不同的培养条件。营养类型及种类不同的微生物需要不同的培养基。自养型微生物的培养基：不能含有机物，由简单的无机物组成。异养型微生物需要在培养基中添加有机物，如异养型细菌常用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。光能营养型需要提供光照。第五页，共六十二页，编辑于2023年，星期五

细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的营养要求既有共性也有特性，应选用不同的培养基。放线菌：麦芽汁培养基；酵母菌：高氏培养基；霉菌：察氏培养基或豆芽汁等培养基。主要几类微生物所需的培养基各不相同。第六页，共六十二页，编辑于2023年，星期五2、营养协调微生物细胞组成元素调查分析，是培养基设计的重要参考依据。培养基中营养物质浓度合适时，微生物才能生长良好。浓度过低，不能满足需要；浓度过高，对其生长有抑制作用，如高渗溶液的抑菌作用。营养物质之间的浓度配比，直接影响微生物的生长繁殖或代谢产物的积累。不同营养物质之间的比例：大体十倍递减。第七页，共六十二页，编辑于2023年，星期五营养协调原则中需要注意的几点其中碳氮比（C/N）的影响较大。碳氮比（C/NRatio）指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮源中氮原子摩尔数之比指培养基中碳源物质与氮源物质的质量比值，也指培养基中还原糖的含量与粗蛋白含量的比值第八页，共六十二页，编辑于2023年，星期五碳氮比的重要性碳源不足，菌体易早衰；氮源过量，菌体生长过旺，代谢产物积累少；氮源不足，菌体生长过慢。真菌：高C/N比细菌：低C/N比我们可以通过控制培养基碳氮比，来调控菌体生长或代谢产物的积累。第九页，共六十二页，编辑于2023年，星期五

培养基中各矿质元素间的比例要适当，防止单盐毒害作用。某种氨基酸过多，发生氨基酸不平衡，将会影响对其它氨基酸的吸收。微量元素除特别需要外，一般不另外供给。因为培养基中所加牛肉膏、蛋白胨、糖及其它无机盐中均含有一定量的微量元素。用自来水配制培养基时，微量元素更不成问题。第十页，共六十二页，编辑于2023年，星期五3、理化条件适宜培养基的理化条件pH水分活度（Aw）和渗透压氧化还原电位（Eh）第十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期五(1)pH各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，各大类微生物都有合适的生长pH范围。通常培养条件细菌和放线菌：pH7.0～7.5酵母菌和霉菌：pH4.5～6.0范围内生长第十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期五在微生物生长繁殖和代谢过程中，常因营养物质的消耗和代谢产物的积累，引起pH变化，导致微生物生长缓慢、代谢产物产量下降。

为避免此现象，维持培养基pH的相对恒定，通常加入pH缓冲剂，进行调节。pH的内源调节磷酸盐缓冲液（KH2PO4、K2HPO4）不溶性碳酸盐CaCO3或碳酸氢钠pH的外源调节指在培养过程中不断或间断向液体培养基中流加酸液或碱液的调节方法。第十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期五(2)水分活度（Aw）和渗透压微生物在等渗环境中良好生长

高渗环境生长受抑：质壁分离

低渗环境脆弱菌体易破裂死亡：吸水膨胀微生物有一定的适应渗透压变化的能力

细胞内渗透压的调节机制渗透压大小由溶液中所含的的分子或离子的质点数决定几个数据

G+细菌：20atm

G-细菌：5～10atm第十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期五第十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期五水分活度水分活度Aw

相同温度和压力下，体系中溶液的水蒸汽压与纯水的蒸汽压之比。亦等于该溶液的百分相对湿度。表示微生物可实际利用的游离水的含量Aw=p/p0微生物生长的最低Aw普通细菌：0.91（嗜盐细菌0.75,葡萄球菌0.85）普通酵母：0.88（耐高渗酵母：0.60）普通霉菌：0.80（干性霉菌：0.65）第十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期五常见食品的水分活度物品名称Aw纯水1.000人血0.995新鲜水果0.97～0.98海水0.98家畜鲜肉0.97面包0.95糖酱、火腿0.90物品名称Aw香肠0.85果酱0.80饱和蔗糖液0.76咸鱼0.75糖果、干果0.70谷物、面粉0.65奶粉0.20第十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期五度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。（3）氧化还原电位（Eh）一般好氧菌：0.1伏以上可生长，0.3-0.4伏适宜兼性厌氧菌：0.1伏以上有氧呼吸；0.1伏以下进行发酵厌氧菌：低于0.1伏的条件下生长不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同。第十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期五影响Eh的因素与氧分压有关受pH影响。pH↓或[O2]↑，Eh↑

增加通气量（如振荡培养、搅拌）提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，可增加Eh；煮沸驱氧后将培养基与空气隔绝，以及在培养基中加入抗坏血酸（0.1%）、硫化氢（0.025%）、半胱氨酸（<0.05%）、铁屑等可降低Eh。第十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期五4、经济节约配制培养基时应尽量选用廉价且易获得的原料做培养基的成分。特别是在发酵工业中，以降低生产成本。以粗代精：糖蜜V蔗糖以野代家：粗木薯粉V优质淀粉以废代好

黄豆浆水

造纸厂亚硫酸废液（含戊糖）以简代繁以无机氮代蛋白以纤代糖以烃代粮以国代进第二十页，共六十二页，编辑于2023年，星期五选用粗原料--对微生物而言，纯度较高的精原料(如蔗糖)其营养成分倒不如纯度低的粗原料(如红糖)完全。粗原料中的所谓“杂质”能提供微生物多种营养要素，且价格较低。设计培养基时应尽量利用粗原料。

----选用工农业副产品--微生物发酵所需的标准原料(如碳源中的糖、淀粉及氮源中蛋白胨等)价格昂贵，农副产品及其它工业的下脚料等价格低廉。故在碳源选择上，应选用富含淀粉的薯类、废糖蜜、麸皮、酒糟、酱渣及纸厂含有戊糖等成分的亚硫酸废液等代替纯淀粉和糖类；在氮源上，用棉子饼粉、蚕蛹粉、豆饼粉及花生饼粉等副产物代替黄豆粉等蛋白质原料。

----选用无机氮源--“无机氮”指硝酸盐、铵盐和尿素等。在培养基中用无机氮作氮源，让微行物将其转化为氨基酸、蛋白质等含氮有机物，生产菌体蛋白。微生物蛋白的生产效率远高于植物和动物蛋白，可补充目前人类食物及动物饲料中蛋白质严重不足。

----选用低浓度培养基--一般认为培养基中营养物质种类愈多、含量愈高其营养愈丰富，发酵效果愈好。但营养物质过多，会造成溶氧量下降，渗透压增大等副效应，对微生物生长不利。故培养基设计应充分考虑营养物的种类和含量，用“稀薄”培养基代替营养物过“浓”的丰富培养基，节约原料，提高发酵产物产量第二十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期五（二）选用和设计培养基的方法生态模拟

自然基质或模拟：初级天然培养基肉汤、鱼汁果汁湿润的麸皮米糠、米饭、面包查阅文献精心设计：优选法或正交实验试验比较培养皿琼脂平板摇瓶培养台式发酵罐第二十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期五二、培养基种类对培养基成分的了解培养基的物理状态培养基对微生物的功能第二十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期五按对培养基成分的了解来分天然培养基合成培养基半合成培养基第二十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期五天然培养基利用化学成分还不清楚或不恒定的天然有机物制成的培养基牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米粉、马铃薯、麸皮、动物组织器官浸出液、麦芽汁培养基特点营养丰富重复性差:成分复杂，每批成分不稳定适于实验室制备基础培养基及大生产种子培养基第二十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期五合成培养基用化学成分和量都确切知道的高纯化学试剂配成的培养基高氏一号（淀粉硝酸盐培养基）柠檬酸盐培养基葡萄糖铵盐培养基蔗糖硝酸盐培养基（察氏培养基）特点

重现性好、价格高、配制繁常用于研究,不宜于大规模生产。第二十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期五半合成培养基由部分天然有机物和部分化学药品配成的培养基。马铃薯蔗糖培养基特点

成本低、配制方便，用于生产、试验

第二十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期五液体培养基固体培养基半固体培养基脱水培养基按物理状态分第二十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期五液体培养基（LiquidMedium）未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，可以通过振荡或搅拌增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。应用微生物生理、代谢研究获得大量菌体：营养物质以溶质状或高度分散态存在，微生物能充分与养料接触，微生物生长快发酵工业大规模生产：工业上常采用液体深层发酵法生产抗生素等多种微生物产品。第二十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期五固体培养基（SolidMedium）外观呈固态的培养基，可在液体培养基中加入凝固剂成固体胨状凝固剂：对大多数微生物来说，琼脂是最理想的凝固剂。1.5－2%琼脂：聚半乳糖的硫酸酯5－12%明胶：蛋白质第三十页，共六十二页，编辑于2023年，星期五理想的凝固剂应具备的条件1、不被所培养的微生物分解利用；2、在微生物生长的范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时，为防止由于高温引起的培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂。3、凝固点温度不能太低，否则不利于微生物的生长。4、对所培养的微生物无毒害作用。5、在灭菌过程中不被破坏。6、透明度好、黏着力强。7、配制方便且价格低廉。第三十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期五常用的凝固剂有琼脂、明胶、硅胶等，对大多数微生物来说，琼脂是最理想的凝固剂。第三十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期五第三十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期五固体培养基的类型固化培养基

凝固剂：琼脂、明胶、海藻酸胶、脱乙酰吉兰糖胶、多聚醇非可逆固化培养基

血清培养基

无机硅胶培养基天然固态培养基

麸皮、米糠、木屑、纤维、稻草粉

马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、大豆、面包

动植物组织培养基滤膜：醋酸纤维薄膜第三十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期五固体培养基的应用应用广泛菌种分离计数选种育种检验杂菌菌种保藏生物活性物质的生物测定真菌孢子微生物固体培养和大规模生产第三十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期五天然固体培养基如小米、大米、麸皮及马铃薯等可直接用作培养基培养霉菌、放线菌。小米麸皮等物质含有一定量碳源和能源物质，又含有大量矿质元素、微量元素和生长素，而且质地疏松透气，比表面大，是培养孢子和制备粗酶制剂的良好培养基。如用麸皮培养黑曲霉生产糖化酶，培养米曲霉生产米曲霉孢子，用蒸煮的大豆接种米曲霉进行固体培养，利用分泌的蛋白酶制作豆酱等。第三十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期五液体培养基中加0.2-0.5%琼脂，表观呈固态，剧烈震荡后则破散。应用菌运动性、趋化性研究细菌、酵母菌菌种保藏厌氧菌的培养分离和计数半固体培养基第三十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期五脱水培养基预制干燥培养基

含有除水以外的一切成分的商品培养基。使用时加适量水并加以灭菌即可生产商品化培养基的公司

Merck第三十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期五按培养基的功能分基础培养基选择性培养基鉴别培养基其他培养基第三十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期五基础培养基尽管不同微生物的营养需求不同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。第四十页，共六十二页，编辑于2023年，星期五选择培养基用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入特殊的营养物质或化学物质，有利于所需微生物生长，抑制或杀死其他微生物。实例红曲霉耐高温耐酸泡菜加富性选择培养基抑制性选择培养基第四十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期五也称为营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。如加入血、血清、动植物组织提取液等，以培养营养要求比较苛刻的异养微生物。加富营养物：特殊的碳源和氮源、甘露醇、纤维素和浓糖。该培养基中生长的微生物并不是一个纯种，而是营养要求相同的一类微生物，用于菌种的保存或菌种的分离筛选。加富性选择培养基第四十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期五抑制性选择培养基在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。选择性抑菌剂：染料、抗生素、脱氧胆酸钠抗生素—抑制细菌、放线菌苯酚—抑细菌、霉菌制霉菌素—抑真菌结晶紫、牛胆酸盐—抑G+细菌亚硫酸铋—抑制革兰氏阳性菌和绝大多数革兰氏阴性菌第四十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期五鉴别培养基添加特定试剂或化学药品对特定微生物鉴别、区分的培养基。添加能够与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而可以用肉眼就能容易地辨别目的菌菌落的培养基；伊红美蓝（EMB）平板

用于检查饮水和乳品中是否含肠道致病菌

E.coli呈紫绿色金属光泽，沙门氏菌菌落无色透明第四十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期五EMB培养基的组成EMB培养基的成分/g蛋白胨：10乳糖：5蔗糖：5K2HPO4：2伊红Y：0.4美蓝：0.065蒸馏水：1000最终pH：7.2第四十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期五第四十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期五第四十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期五培养基中常用的指示剂酸碱指示剂酚红溴甲酚紫溴荫香草酚蓝中性红中国蓝甲基红酸性复红氧化还原指示剂：美蓝和刃天青第四十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期五1．配制：计算、称量、溶解2．调节pH：用3%的HCI/NaOH调节，pH7.0-7.23．溶化琼脂

4．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。培养基的配制编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml第四十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期五

5．灭菌任何培养基一旦配成，必须立即灭菌处理。只能灭菌一次。

常规高温蒸汽灭菌

（1.05kg/㎝2,

121.3℃,15-30min）某些成分进行分别灭菌过滤除菌第五十页，共六十二页，编辑于2023年，星期五6．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板平板冷凝后，要将平板倒置。7．检查培养基制作是否合格：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。第五十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期五编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.