第十三章基因工程

第十三章基因工程第一页，共三十四页，编辑于2023年，星期五第十三章基因工程（GeneEngineering）在各种酶的作用下，将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接，形成重组的DNA分子，以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞，并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。要点：供体、载体、受体基因工程分狭义（上游）：重组、克隆、表达的设计和构建。广义（下游）：表达工程菌的发酵培养和产物的纯化。目的：DNA扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。第二页，共三十四页，编辑于2023年，星期五基因工程限制性内切酶和载体是基因工程的众多理论与技术基础中最重要的基石。基因工程的基本步骤可概括为：目的基因的获得(基因克隆)；目的基因与载体连接(DNA分子重组)；重组DNA分子导入受体；转化子的筛选、鉴定。第三页，共三十四页，编辑于2023年，星期五限制性内切酶与DNA连接酶细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用：特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)；I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列；II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接成重组DNA分子。通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。重组DNA技术是基因工程最核心的技术。第四页，共三十四页，编辑于2023年，星期五载体(vector)用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。常用基因工程载体有：细菌质粒(克隆)；λ噬菌体(克隆)；柯斯质粒(克隆)；穿梭质粒(克隆/表达)；细菌人工染色体(克隆/表达)；酵母人工染色体(克隆/表达)；Ti质粒及其衍生载体(转化)。第五页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(一)、目的基因的获得基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。1.基因库构建与目的基因分离；2.PCR扩增、克隆基因；3.基因合成(化学法、酶促法)。获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、表达机制以及表达机制研究。第六页，共三十四页，编辑于2023年，星期五克隆的含义名词(pl.clones)：克隆、无性(繁殖)系。生物个体、细胞的无性繁殖系；同一基因或DNA片段的多份拷贝。动词(cloning)：克隆。细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞；分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有①将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利用宿主细胞DNA复制系统进行复制；②利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR,聚合酶链式反应)。第七页，共三十四页，编辑于2023年，星期五基因库构建与目的基因分离基因库(基因文库)：包含特定基因组所有基因、DNA区段的全部分子克隆的集合体。根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库和线粒体库等。构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因克隆(亚克隆)的方法。第八页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(二)、转基因受体受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、受体的再生等都有很大的影响。植物基因工程常用受体：组织、器官、悬浮培养细胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官发生、胚状体或直接发育形成转基因植株。动物基因工程受体主要有两类：一是受精卵或早期胚胎，发育形成转基因动物。转基因动物获得的性状可以稳定的遗传，表明外源基因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是体细胞无性系。第九页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(三)、目的基因导入受体将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是基因工程目标实现的关键环节。在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化，将接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称为转化体/转化子。最常用转化方法是：载体导入；理化方法导入(微注射、基因枪、电穿孔法、化学法)；还有一种特殊的方法是将外源总DNA导入植物。第十页，共三十四页，编辑于2023年，星期五1.载体法导入外源基因载体法——将目的基因连接到特定的载体(转化载体)上，利用载体进入细胞并整合到受体染色体上的能力实现外源基因转化。Ti质粒及其衍生载体是最常用的植物基因工程转化载体，具有导入外源基因并整合到染色体上的能力。将目的基因与载体连接的过程就是重组DNA分子构建的过程。将含有转化载体(重组DNA分子)的根癌农杆菌与受体共培养就可以实现转化。第十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期五2.理化方法导入外源基因理化方法是采用物理、化学方法使受体细胞膜产生局部破损或缺陷，被动吸纳外源DNA片段。(1)微注射/显微注射。显微镜下用注射器将DNA片段注入受体细胞(动物受精卵)。Ø：0.5-10μm尖头玻璃管。(2)基因枪。将DNA片段(载体)包在钨或金微粒表面(Ø1-3μm)，用静电或火药爆炸等驱动微粒射入受体。(3)电穿孔法。将受体细胞置于脉冲电场中，可以使细胞膜产生短暂的(Ø30nm)左右的微孔，吸收DNA片段。(4)化学法。如PEG(聚乙二醇)可以刺激原生质体产生吸收DNA片段。常用PEG与电穿孔法结合，提高外源DNA的吸收率。第十二页，共三十四页，编辑于2023年，星期五第十三页，共三十四页，编辑于2023年，星期五*3.外源总DNA导入植物国内生物科技工作者受基因工程在从分子水平进行基因转移的启发，设计了一些外源DNA导入植物的方法。下述两种方法均是采用供体植物的全部DNA提取物作为操作材料，省去了目的基因获得的过程，所以称为外源总DNA导入。减压渗透法花粉管通道导入法第十四页，共三十四页，编辑于2023年，星期五*(四)、转化体的筛选与鉴定转化体筛选：根据转基因技术设计进行，如：载体上带有特异性状标记，特别是某种抗生素抗性等。转化体鉴定有两个层次：目的基因是否进入受体(可以是大肠杆菌、酵母、植物或动物)，得到转化体。

常用方法：限制性酶谱分析、核酸分子杂交、核酸序列测定、序列分析、RFLP等一切可鉴定特定DNA片段的方法。第十五页，共三十四页，编辑于2023年，星期五第十六页，共三十四页，编辑于2023年，星期五第十七页，共三十四页，编辑于2023年，星期五第十八页，共三十四页，编辑于2023年，星期五基因工程的特点：从分子水平出发，以DNA为操作对象，直接对基因进行操作。基因工程的意义：基因工程的成就与展望：原核生物真核生物转基因动物转基因植物第十九页，共三十四页，编辑于2023年，星期五*二、染色体工程染色体工程是物种间遗传转移的最传统的方式，也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体、三体等方法，获得新的染色体组合。其重要性因作物不同而异：对蕃茄而言，世界上任何具有商业价值的栽培品种都带有一个从野生种导入的抗枯萎病性状，其它六个野生种则是耐盐性、抗虫性等性状的来源。小麦许多抗白粉病基因和抗锈病基因都来源于其野生近缘物种。相反，蚕虫改良则完全是在栽培种内进行杂交选择。现在还不能从其它任何种导入基因到该作物中。第二十页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(一)、种间有性杂交生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易直接影响外源基因导入栽培作物。对不同的作物而言，种间杂交障碍的机制可能截然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：受精前柱头和花柱中的障碍；受精过程中的障碍；受精后胚与种子发育过程中的障碍。第二十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期五受精前障碍与克服障碍机制：物种间花粉管与雌蕊不亲和，在花粉管到达胚珠之前，停止伸长而不能受精。主要克服办法：主要是选择适当的授粉时期，采用正反杂交、蒙导授粉、植物生长调节剂等。另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种内均存在可杂交性遗传变异，并受简单遗传控制。利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。第二十二页，共三十四页，编辑于2023年，星期五受精过程的障碍与克服被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往往是由于双受精之一失败引起的。讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有成效的研究领域。第二十三页，共三十四页，编辑于2023年，星期五受精后发育障碍与克服受精过程的障碍机制：受精胚珠发育过程中也经常由于胚、胚乳和母本组织发育异常或发育不平衡而最终不能产生种间杂种种子。克服方法：常用技术是从生理角度进行调节，如：采用植物生长调节剂或去除母本植株的营养生长中心。提高亲本倍性水平，可能有利于胚珠发育。通过离体培养方法可以挽救可能(即将)败育的杂种胚。第二十四页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(二)、双二倍体的合成获得种间杂种不一定就能在物种间进行遗传转移。物种间的不亲和性不仅表现在受精前、受精及受精后各过程中；亲缘关系较远的物种间杂种往往存在不同程度不育性；因而难以进行基因转移。事实上许多种间杂交试验都仅限于获得杂种F1。加倍杂种染色体数目，双二倍体中亲本染色体均成对存在，可能产生可育配子；稳定双二倍体可作为新物种直接用于生产。但由于合成双二倍体往往常有野生种的不利性状，农艺价值降低。第二十五页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(三)、削减、添加、代换、易位绝大多数双二倍体遗传不稳定，在种间杂种及其双二倍体基础上，人们设计了许多染色体操作方案，以导入外源目的基因，并尽可能避免导入对受体有害的遗传物质。理想的情况是只掺入目的基因，而排除外源物种的其它基因。由于遗传重组可能性有限，所以导入整条染色体(异附加系、异代换系)是利用外源基因的一种重要方式。外源染色体上连锁的不利基因往往极大地限制附加系和异代换系的利用价值，因而可以采用：辐射、遗传、单体附加等方式诱导外源染色体与栽培物种染色体易位。第二十六页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(四)、染色体工程中的现代技术在传统远缘杂交的基础上采用的现代技术主要是：离体胚(子房)培养技术；植物染色体显带技术；染色体分子原位杂交技术等。染色体工程仍然是外源基因转移最有效、最接近实际应用的技术。第二十七页，共三十四页，编辑于2023年，星期五*三、细胞工程利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种、产品和保存珍贵物种。主要包括体细胞融合，核移植，细胞器摄取和染色体片段的重组等。细胞工程主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。第二十八页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(一)、细胞、原生质体植株再生采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。植物：细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近二十多年来也已取得巨大进展。动物：“多利”的诞生表明，动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。第二十九页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(二)、植物原生质体作为基因工程的受体最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。在这些组织、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化子。因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。第三十页，共三十四页，编辑于2023年，星期五(三)、细胞、原生质体融合体细胞融合是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，这就打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功，但局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。

用杂种细胞核代替维尔·穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。如今已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚