核酸与核苷类药物概述及合成工艺演示文稿

核酸与核苷类药物概述及合成工艺演示文稿本文档共66页；当前第1页；编辑于星期六\7点9分（优选）核酸与核苷类药物概述及合成工艺本文档共66页；当前第2页；编辑于星期六\7点9分核酸类物质药物一般可分为两大类：一类具天然结构的核酸类物质，另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。本文档共66页；当前第3页；编辑于星期六\7点9分

前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶Ⅱ等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。

本文档共66页；当前第4页；编辑于星期六\7点9分后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。本文档共66页；当前第5页；编辑于星期六\7点9分二、核酸与核苷的一般理化性质核糖（核糖脱氧核糖）核苷嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基核酸核苷酸嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中；RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。本文档共66页；当前第6页；编辑于星期六\7点9分第二节一些药物的制备工艺及原理一、RNA的提取与制备

工业用RNA的提取（1）RNA及其工业来源：从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素，制霉菌素等菌体。通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。本文档共66页；当前第7页；编辑于星期六\7点9分

在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。

很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选

可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。本文档共66页；当前第8页；编辑于星期六\7点9分

稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAMr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3－4h破坏酶)。

浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%－8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。

本文档共66页；当前第9页；编辑于星期六\7点9分（3）RNA的提取实例：

啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol／LHCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g（纯度80％）。本文档共66页；当前第10页；编辑于星期六\7点9分RNA提取实例：

[提取][中和]HCl[酸化、沉淀]HCl酵母提取液上清液RNA

NaOH、水pH7、离心pH2.5、离心本文档共66页；当前第11页；编辑于星期六\7点9分二、DNA的提取与制备

工业用DNA的提取

取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。本文档共66页；当前第12页；编辑于星期六\7点9分工业用DNA的提取

[提取][热变性][沉淀]乙醇鱼精提取液纤维状DNA

水、100℃

冷却、离心70%--80%

（无生物活性）

15min

干燥粗品DNA（热变性后无活性）本文档共66页；当前第13页；编辑于星期六\7点9分

具有生物活性DNA的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在0～3℃操作）。本文档共66页；当前第14页；编辑于星期六\7点9分生物活性DNA的制备

[提取]

[洗涤3次]5%SDS

动物内脏沉淀沉淀上层液（肝、脾）生理盐水生理盐水[再捣碎]

离心、30min[沉淀][洗涤、干燥][提取]

纤维状DNA粗品DNA上清液

95%乙醇冷乙醇、丙酮水、5%SDS

离心

[沉淀][洗涤、干燥]DNA沉淀活性DNANaCL、95%乙醇乙醇、丙酮本文档共66页；当前第15页；编辑于星期六\7点9分三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸

1、酶解法及碱水解法制备核苷酸

酶解法制备脱氧核苷酸

桔青霉产生5`-磷酸二脂酶

红酵母产生3`-磷酸二脂酶本文档共66页；当前第16页；编辑于星期六\7点9分

本文档共66页；当前第17页；编辑于星期六\7点9分

酶解法制备戊糖核苷酸

我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程本文档共66页；当前第18页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第19页；编辑于星期六\7点9分双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）

呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。本文档共66页；当前第20页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第21页；编辑于星期六\7点9分菌体自溶法生产核苷酸

磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸。（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：本文档共66页；当前第22页；编辑于星期六\7点9分

碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸

RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2′，3＇

-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇-核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。本文档共66页；当前第23页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第24页；编辑于星期六\7点9分发酵法生产核苷酸1、发酵法生产肌苷酸（IMP）肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。

产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制:本文档共66页；当前第25页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第26页；编辑于星期六\7点9分

积累IMP的主要前提：（1）阻断SAMP合成酶:

即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；（2）保持PRA合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应；（3）要使IMP渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌株；（4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。本文档共66页；当前第27页；编辑于星期六\7点9分2、混合培养法发酵生产鸟苷酸（GMP）:

直接发酵法生产GMP必需满足以下条件（1）解除GMP的反馈抑制（与GMP积累相勃）;（2）改变细胞对GMP的透性;（3）不分解生成GMP

只能先合成XMP，后转化为GMP：方法如下：

选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除PRPP转酰胺酶及XMP合成酶的阻遏，积累大量XMP(GMP合成酶及SAMP合成酶缺失）。本文档共66页；当前第28页；编辑于星期六\7点9分XMP转化为GMP菌株的条件:(1)GMP不被分解

(2)GMP合成酶活力要强化(抗生素激动剂)(3)增加细胞通透性本文档共66页；当前第29页；编辑于星期六\7点9分

半合成法制备核苷酸由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L，反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。本文档共66页；当前第30页；编辑于星期六\7点9分四、核苷的制备

核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。（1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种；（2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；（3）核苷的发酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前体物质。1、RNA化学水解法制备核苷：本文档共66页；当前第31页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第32页；编辑于星期六\7点9分2、发酵法生产核苷

产率高、周期短、控制容易、产量大。共同特点：（1）使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株；（2）具有特定标记的有变株；（3）发酵培养时需提供限量生长因素。原菌株：（1）AMP强烈抑制PRPP转酰胺酶的活性，控制总代谢途径；（2）AMP抑制SAMP合成酶；（3）GMP抑制IMP脱氢酶本文档共66页；当前第33页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第34页；编辑于星期六\7点9分生产菌株：（1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP---肌苷（肝炎辅助药）；（2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP---黄苷；（3）酶5缺失积累鸟苷。本文档共66页；当前第35页；编辑于星期六\7点9分发酵法生产肌苷（1）肌苷生产工艺（2）发酵工艺条件：碳源为葡萄糖保证充足的氮源磷酸盐的影响Mg+、Ca+有促进作用生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量最适发酵温度为30--34℃，pH6.0—6.2需大风量,高溶氧和低CO2本文档共66页；当前第36页；编辑于星期六\7点9分发酵法生产肌酐的工艺流程本文档共66页；当前第37页；编辑于星期六\7点9分发酵法生产鸟苷和黄苷

鸟苷产生菌的特征：（1）嘌呤核苷酸分解酶活力强；（2）SAMP合成酶，GMP还原酶缺失；（3）解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶和GMP合成酶的反馈抑制；本文档共66页；当前第38页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第39页；编辑于星期六\7点9分发酵法生产腺苷

以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。诱变结果：（1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；（2）黄嘌呤缺陷型，GMP还原酶缺失；（3）抗8杂氮黄嘌呤解除对PRPP转酰胺酶的抑制；（4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复（菌种传代中）。本文档共66页；当前第40页；编辑于星期六\7点9分第三节核酸与核苷类药物的制备举例

本文档共66页；当前第41页；编辑于星期六\7点9分（一）叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）1、结构与性质

AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3`-叠氮-2′-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。2、生产工艺此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。本文档共66页；当前第42页；编辑于星期六\7点9分

已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：

①从2′-脱氧胞苷或2′-脱氧鸟苷或2＇-脱氧腺苷与胸腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。

②从鸟苷（300mmol／L）与胸腺嘧啶（300mmol／L）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。本文档共66页；当前第43页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第44页；编辑于星期六\7点9分（二）阿糖腺苷（Adeninearabinoside）1、结构与性质

阿糖腺苷的化学名称为9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用StreptomycesantibioticusNRRL3238菌株，1972年日本用Strepto－myceshebacecus4334菌株发酵法分别制备了阿糖腺苷。

1979年用从E．Coli中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷。本文档共66页；当前第45页；编辑于星期六\7点9分2、生产工艺酶-化学合成法

最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用尿苷为原料经氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应，生成氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖经酶法转化成阿糖腺苷。经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），用这个菌株的休止细胞作为酶源，从阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞进行连续生产。本文档共66页；当前第46页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第47页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第48页；编辑于星期六\7点9分以5`-AMP为原料的化学合成

3、作用与用途

阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。目前认为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷，是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物，从而阻抑了以dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。本文档共66页；当前第49页；编辑于星期六\7点9分

（三）三氮唑核苷1、结构与性质

三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174～176℃，易溶于水。这个化合物经X线解析，它的立体结构与腺苷、鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多，不易使病毒产生抗药性。

本文档共66页；当前第50页；编辑于星期六\7点9分2、生产工艺

酶合成法

使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷。

采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。本文档共66页；当前第51页；编辑于星期六\7点9分（四）阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosinearabinoside，ArabinosylCytosine，Aracytidine）

1、结构与性质

阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射。本文档共66页；当前第52页；编辑于星期六\7点9分2、生产工艺

以5＇－CMP为原料的合成法（1）工艺路线：本文档共66页；当前第53页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第54页；编辑于星期六\7点9分（2）工艺过程：

①水解：并加入处理好的6.5L氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90℃，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶液，离心分离，取上清液5至10μl，pH9.2电泳分析，检查水解程度。②氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm（pH2）③氨解：使氧桥断裂3‘，5’-乙酰基脱落。④成盐：

2％盐酸-甲醇以葡萄糖酸钙为原料的合成路线

本文档共66页；当前第55页；编辑于星期六\7点9分本文档共66页；当前第56页；编辑于星期六\7点9分（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic，PolycytidylicAcid，Poly1：C）1、结构与性质

1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85％氯化钠溶液。2、生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备本文档共66页；当前第57页；编辑于星期六\7点9分（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。本文档共66页；当前第58页；编辑于星期六\7点9分3、PolyI：C制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。（2）酶促反应：（每毫升反应液含μmol／L数）IDP或CDP15；Tris150；MgC126；EDTA1；聚合酶5单位，pH9.0，37℃，3～4小时。用盐酸调pH1.5～2.0，使PolyI（或PolyC）沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔PolyI与PolyC混合，生成产品。

本文档共66页；当前第59页；编辑于星期六\7点9分3、作用与用途

本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患。本文档共66页；当前第60页；编辑于星期六\7点9分

胞二磷胆碱（CDP-胆碱）1、结构与性质

胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5＇-二磷酸胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。1％水溶液pH2.5～3.5，注射液pH7.0。

本文档共66页；当前第61页；编辑于星期六\7点9分2、生产工艺

酶合成法

胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸胆碱而合成，国内使用啤酒生产中废弃的酵母，反应体系为：磷酸二氢钾～氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200mol／ml，CMP20μmol／ml，磷酰胆碱

30μmol／ml，葡萄糖1000μmol／ml，MgSO4.7H2O20μmol／ml，酵母泥

550mg／m1。上述反应体系于28℃保温20小时，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80％。本文档共66页；当前第62页；编辑于星期六\7点9分

粘性红酵母发酵法国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。

菌体培养基（g／L）：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO42；（NH4）2HPO42；MgSO4.7H2O1；pH6.0，经28℃，22h培养，收集菌体，菌体经