荧光定量技术和常见问题详解演示文稿

荧光定量技术和常见问题详解演示文稿本文档共108页；当前第1页；编辑于星期三\16点15分（优选）荧光定量技术和常见问题本文档共108页；当前第2页；编辑于星期三\16点15分荧光定量PCR是什么一种实时监控目的基因PCR扩增的技术本文档共108页；当前第3页；编辑于星期三\16点15分定量PCR是如何工作的?传统PCR

具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA本文档共108页；当前第4页；编辑于星期三\16点15分与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:>双链DNA模板变性>引物与模板退火>引物延伸

新的扩增片段定量PCR是如何工作的?理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍本文档共108页；当前第5页；编辑于星期三\16点15分在PCR混合液中含有荧光物质。定量PCR是如何工作的?本文档共108页；当前第6页；编辑于星期三\16点15分无论哪个型号，所有的荧光定量PCR仪都有三个共同的组成部分定量PCR是如何工作的?本文档共108页；当前第7页；编辑于星期三\16点15分PCRPCRLotsofPCRPCRproduct随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加定量PCR是如何工作的?本文档共108页；当前第8页；编辑于星期三\16点15分Real-timePCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:本文档共108页；当前第9页；编辑于星期三\16点15分为什么要用定量PCR？

重复性好

灵敏度高

动力学范围宽一个好的定量PCR数据本文档共108页；当前第10页；编辑于星期三\16点15分1:重复性好本文档共108页；当前第11页；编辑于星期三\16点15分2:灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因本文档共108页；当前第12页；编辑于星期三\16点15分3:动态范围宽兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围(越大越好)本文档共108页；当前第13页；编辑于星期三\16点15分为什么要用定量PCR？

快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。本文档共108页；当前第14页；编辑于星期三\16点15分为什么要用定量PCR？

安全：不用EB或放射性物质本文档共108页；当前第15页；编辑于星期三\16点15分定量PCR的化学原理本文档共108页；当前第16页；编辑于星期三\16点15分支持的化学试剂SYBR®GreenITaqMan®本文档共108页；当前第17页；编辑于星期三\16点15分TaqMan®

中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第18页；编辑于星期三\16点15分第三段短片段序列，又称为探针,位于序列中间TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第19页；编辑于星期三\16点15分报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye探针标记两种

染料分子TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第20页；编辑于星期三\16点15分Reporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)完整的探针TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第21页；编辑于星期三\16点15分光能然而，如果探针断裂了……TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第22页；编辑于星期三\16点15分Denaturation变性(95ºC)TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第23页；编辑于星期三\16点15分Annealing退火(60ºC)TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第24页；编辑于星期三\16点15分Taq酶登场……TaqMan®

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本文档共108页；当前第25页；编辑于星期三\16点15分找到引物序列……TaqMan®

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本文档共108页；当前第26页；编辑于星期三\16点15分开始延伸(60ºC)TaqMan®

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本文档共108页；当前第27页；编辑于星期三\16点15分Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第28页；编辑于星期三\16点15分Extension延伸(60ºC)TaqMan®

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本文档共108页；当前第29页；编辑于星期三\16点15分?Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

本文档共108页；当前第30页；编辑于星期三\16点15分Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqMan®

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本文档共108页；当前第31页；编辑于星期三\16点15分Taq酶降解探针TaqMan®

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本文档共108页；当前第32页；编辑于星期三\16点15分Taq酶降解探针TaqMan®

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本文档共108页；当前第33页；编辑于星期三\16点15分Taq酶降解探针TaqMan®

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本文档共108页；当前第34页；编辑于星期三\16点15分Taq酶降解探针TaqMan®

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本文档共108页；当前第36页；编辑于星期三\16点15分Taq酶降解探针TaqMan®

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本文档共108页；当前第37页；编辑于星期三\16点15分Taq酶降解探针TaqMan®

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本文档共108页；当前第49页；编辑于星期三\16点15分TaqMan®

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本文档共108页；当前第50页；编辑于星期三\16点15分嗝!TaqMan®

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本文档共108页；当前第51页；编辑于星期三\16点15分SYBR®GreenI化学原理本文档共108页；当前第52页；编辑于星期三\16点15分SYBR®GreenI染料本文档共108页；当前第53页；编辑于星期三\16点15分SYBR®GreenI染料本文档共108页；当前第54页；编辑于星期三\16点15分SYBR®GreenI染料本文档共108页；当前第55页；编辑于星期三\16点15分SYBR®GreenI染料的缺点非特异结合任意

双链DNA定量结果不准确非特异性PCR产物信号本文档共108页；当前第56页；编辑于星期三\16点15分使用熔解曲线Meltcurve(DissociationCurve)检查反应特异性TemperatureFluorescence本文档共108页；当前第57页；编辑于星期三\16点15分Meltcurve:

导数图谱一个干净的峰=没有无关的产物TemperatureFluorescence本文档共108页；当前第58页；编辑于星期三\16点15分Meltcurve的杂峰可能是引物二聚体本文档共108页；当前第59页；编辑于星期三\16点15分多余的峰是如何产生的?非特异扩增1、转录组中错误的目的基因。2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组DNA又检测cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高的Tm值)。解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点

引物二聚体本文档共108页；当前第60页；编辑于星期三\16点15分到底用哪一种化学方法呢？TaqMan®,还是SYBR®Green?...本文档共108页；当前第61页；编辑于星期三\16点15分TaqMan®,还是...

SYBR®GreenI?优点更高的特异性

不会有引物二聚体干扰支持多重荧光实验设计实验方法易于优化缺点价格稍贵优点价格便宜大部分基因以及少量样品均适用缺点特异性稍差必须要做Meltcurves不支持多重荧光设计实验方法通常需要优化本文档共108页；当前第62页；编辑于星期三\16点15分定量PCR的数学原理本文档共108页；当前第63页；编辑于星期三\16点15分怎样获得结果首先让我们定义扩增曲线的各种参数。本文档共108页；当前第64页；编辑于星期三\16点15分PCR的动力学曲线和四个阶段本文档共108页；当前第65页；编辑于星期三\16点15分指数扩增期重复性准确性动态范围3个阶段中最佳时期本文档共108页；当前第66页；编辑于星期三\16点15分只有一个扩增期提供高质量的数据指数扩增期本文档共108页；当前第67页；编辑于星期三\16点15分基线基线（空白）信号的产生是由于背景引起的本文档共108页；当前第68页；编辑于星期三\16点15分阈值默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10本文档共108页；当前第69页；编辑于星期三\16点15分怎么获得结果第一步：确定Ct值本文档共108页；当前第70页；编辑于星期三\16点15分怎么获得结果第二步：比较Ct值本文档共108页；当前第71页；编辑于星期三\16点15分定量PCR的应用绝对定量相对定量阴阳性鉴定基因分型本文档共108页；当前第72页；编辑于星期三\16点15分定量PCR实验设计和流程

---绝对定量和相对定量本文档共108页；当前第73页；编辑于星期三\16点15分定量PCR的实验要素

目的基因样品标准曲线标准品监控系统故障阳性对照监控污染阴性对照校准生物学误差内参(管家基因)校准物理误差参比荧光降低随机误差重复实验本文档共108页；当前第74页；编辑于星期三\16点15分相对定量实验示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1实验目的：样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化？本文档共108页；当前第75页；编辑于星期三\16点15分实验流程对照样本本文档共108页；当前第76页；编辑于星期三\16点15分两种相对定量的方法比较Ct（ΔΔCt）法相对标准曲线法样本间目的基因的倍数关系本文档共108页；当前第77页；编辑于星期三\16点15分两种方法的区别

比较Ct(ΔΔCt)法

相对标准曲线法*已知各个基因的扩增效率*每个基因都要做一条标准曲线*不需要每次都做标准曲线*准确的扩增效率计算*简单,经济,通量较高*工作量大,成本高,通量较低本文档共108页；当前第78页；编辑于星期三\16点15分如何选择相对定量的方法本文档共108页；当前第79页；编辑于星期三\16点15分如何选择相对定量的方法本文档共108页；当前第80页；编辑于星期三\16点15分如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表本文档共108页；当前第81页；编辑于星期三\16点15分如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表斜率<0.1斜率>0.1比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法本文档共108页；当前第82页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法必要条件：目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%。本文档共108页；当前第83页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法如何确认扩增效率接近100%？每条引物一条标准曲线本文档共108页；当前第84页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法标准曲线可以帮助判定扩增效率例如：斜率-3.3说明扩增效率接近100%；更小的负值（如-3.5）说明扩增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1本文档共108页；当前第85页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法结果计算步骤一：内参基因均一化样本差异Ct目的基因-Ct目的基因=

ΔCt步骤二：处理样本和对照样本作比较

ΔCt处理样本-ΔCt对照样本=

ΔΔCt步骤三：使用公式计算

倍数变化

=2

-ΔΔCt本文档共108页；当前第86页；编辑于星期三\16点15分公式含义2

-ΔΔCt2=循环间扩增产物量的变化（PCR扩增产物倍增）ΔΔCt=处理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化。本文档共108页；当前第87页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法计算示例本文档共108页；当前第88页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法计算示例为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理。本文档共108页；当前第89页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法计算示例首先，选择对照样本；接着，均一化对照样本；然后，所有样本和对照样本进行比较。本文档共108页；当前第90页；编辑于星期三\16点15分ΔΔCt法计算示例最后，计算出倍数关系2

–ΔΔCt。本文档共108页；当前第91页；编辑于星期三\16点15分相对标准曲线法每对引物做一条相对标准曲线本文档共108页；当前第92页；编辑于星期三\16点15分相对标准曲线法计算示例表示倍数差异本文档共108页；当前第93页；编辑于星期三\16点15分绝对定量实验

目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系；

要求：

浓度已知

标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%

–仪器质量一致

–试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓

冲液成分

–反应条件一致：循环参数相同、同一次实验标准品的准备本文档共108页；当前第94页；编辑于星期三\16点15分绝对定量实验Don’t:−制备3个点的2倍标准曲线要求：Do:−制备至少5个点的标准曲线(4logs)−去除离散的重复孔，或者有必要时去除整个梯度数据如何制备标准曲线本文档共108页；当前第95页；编辑于星期三\16点15分绝对定量实验

选择目标→提取/PCR→纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释Ct值在17-30之间，覆盖全部样品浓度区间10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v注：不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v标准品梯度稀释方法本文档共108页；当前第96页；编辑于星期三\16点15分绝对定量实验扩增效率：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比。PCR效率的测定本文档共108页；当前第97页；编辑于星期三\16点15分常见问题分析本文档共108页；当前第98页；编辑于星期三\16点15分1.扩增效率为什么达不到100%主要原因：样品不纯扩增产物太长没有选择合适的引物退火温度引物的设计有错配模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在本文档共108页；当前第99页；编辑于星期三\16点15分2.扩增效率为什么会大于100%主要原因：背景污染非特异性扩增本文档共108页；当前第100页；编辑于星期三\16点15分3.实验结果的重复性不好对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为3个重复）目标是所有复孔CT值都相近(通常SD值小于0