发酵染菌及其防治

发酵染菌及其防治第一页，共五十三页，编辑于2023年，星期日第一章发酵工程总论第二章发酵设备第三章发酵工业原料及其处理第四章发酵灭菌与无菌空气制备第五章发酵菌种的制备第六章发酵工业放大第七章发酵机制第八章发酵动力学第九章发酵过程工艺控制第十章发酵染菌及防治第十一章发酵工业废物、废水处理和资源化技术第十二章展望发酵工程发酵工程第二页，共五十三页，编辑于2023年，星期日第一节染菌对发酵的影响第二节发酵染菌的分析第三节杂菌污染的途径和防止染菌第十章发酵染菌及其防治发酵工程第三页，共五十三页，编辑于2023年，星期日所谓发酵染菌是指在发酵过程，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。国外抗生素发酵染菌率为2%~5%，国内的青霉素发酵染菌率2%，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5%;谷氨酸发酵噬菌体(Phage）感染率1%~2%。

第四页，共五十三页，编辑于2023年，星期日发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失。扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量。第五页，共五十三页，编辑于2023年，星期日第一节染菌对发酵的影响一、染菌对不同发酵过程的影响二、染菌发生的不同时间对发酵的影响三、染菌程度对发酵的影响第六页，共五十三页，编辑于2023年，星期日由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。一、染菌对不同发酵过程的影响第七页，共五十三页，编辑于2023年，星期日青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。一、染菌对不同发酵过程的影响第八页，共五十三页，编辑于2023年，星期日不同的染菌时期对发酵所产生的影响也是有区别的。二、染菌发生的不同时间对发酵的影响种子培养期发酵前期发酵中期发酵后期第九页，共五十三页，编辑于2023年，星期日种子培养期染菌二、染菌发生的不同时间对发酵的影响种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基地营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。第十页，共五十三页，编辑于2023年，星期日发酵前期染菌二、染菌发生的不同时间对发酵的影响在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。第十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期日发酵中期染菌二、染菌发生的不同时间对发酵的影响发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现、快处理。第十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期日发酵后期染菌二、染菌发生的不同时间对发酵的影响由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸等地发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。第十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期日三、染菌程度对发酵的影响当生产菌在发酵过程已大量繁殖，并已在发酵液中占优势，污染极少量的杂菌，对发酵不会带来太大影响。但如果在发酵前期或发酵的中期染菌程度严重时，将对发酵产生严重影响。第十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期日第二节发酵染菌的分析一、发酵染菌后的异常现象二、染菌的检查和判断三、染菌原因分析第十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期日１、种子培养染菌后的异常现象

菌体浓度异常理化指标异常代谢异常一、发酵染菌后的异常现象２、发酵染菌后的异常现象

菌体浓度异常pH值过高或过低溶解氧及CO2水平异常泡沫过多代谢异常第十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期日1显微镜检查法二、染菌的检查和判断用革兰氏染色法对样品进行涂片染色，显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌和杂菌的特征进行区别、判断是否染色。如发现了与生产菌形态特征不一样的其他微生物存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、直接，也是常用的方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。第十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期日2肉汤培养法

通常用足成为0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4%的酚红溶液（pH=7.2)的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37℃进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也用于噬菌体的检查。第十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期日3平板划线培养或斜面培养检查法将待检样品在无菌平板上划线，分别于37℃、27℃进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否染菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37℃条件下培养6h，使杂菌迅速增值后再划线培养。

无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生浑浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。第十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期日4双层平板培养法

此法主要是用在噬菌体检查上。培养基组成根据实际情况可以变动。培养基灭菌后冷却至45~50℃，以无菌操作倒人平皿内，每只平皿倒人培养基8~10mL左右，下层培养基凝固后，移入32℃恒温箱内空白培养48h后，检查无菌备用;无菌操作下，用接种环刮取斜面菌苔混在5mL无菌生理盐水中，作为指示菌备用;吸取5mL待测样品和0.5mL指示菌液于无菌空白试管内，倒人事先溶解好的冷却至45~50℃的装有5mL上层培养基的试管中，混合后倒人下层平板中，冷却后于32℃恒温下培养20h，观察有无噬菌斑。

第二十页，共五十三页，编辑于2023年，星期日由于无菌试验取样少，从取样到得出结果耗时长，因此不能完全依赖于无菌检查来判断染菌的发生。在生产中，应当结合发酵过程中发生的种种异常现象来进行判断。第二十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期日三、染菌的原因分析发酵染菌率计算基准

总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。总染菌率%=×第二十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期日造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：第二十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期日项目百分率%种子带菌或怀疑种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析第二十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期日项目百分率%种子带菌14.15盘管穿孔14.20阀门渗漏23.30空气系统有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78上海第三制药厂染菌原因分析第二十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期日项目百分率%进罐前未做设备严密度检查25.8接种违反操作规程25.8检修质量缺乏验收制度19.35操作不熟练19.35配料违反工艺规程6.45调度不当3.25管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08％经分析有下表所列原因第二十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期日

项目百分率%外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔7.601空气系统有菌26.00停电罐压跌零1.603接种11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足0.604管理问题7.80

操作违反规程1.60种子带菌0.602原因不明35.00某厂链霉素发酵染菌原因分析第二十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期日造成染菌的主要原因总结1、设备渗漏

设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％，上海三厂的分析这类染菌为37.5％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。第二十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期日2、空气净化达不到要求带菌从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96％和26%。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。第二十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期日3、种子带菌种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。第三十页，共五十三页，编辑于2023年，星期日5、技术管理不善技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理。4、培养基灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系第三十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期日第三节杂菌污染的途径和防治一、种子带菌及其防治二、空气带菌及其防治三、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治四、发酵染菌后的措施五、噬菌体污染及其防治第三十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期日第三节杂菌污染的途径和防治一、种子带菌及其防治种子带菌而发生的染菌率虽然不高，但它是发酵前期染菌的重要原因之一，是发酵生产成败的关键。种子染菌的原因主要有保藏的斜面试管染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所涉及的设备和装置染菌等。第三十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期日严格控制无菌室的污染。根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用。对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，是灭菌的温度达不到要求，造成灭菌的不彻底而使种子染菌。针对上述原因，生产上常用以下的一些措施予以防治：第三十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期日二、空气带菌及其防治空气过滤除菌设备流程空压机储罐二级冷却加热器空气过滤粗过滤第三十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期日要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和添装、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。二、空气带菌及其防治第三十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期日三、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治设备渗漏主要是指发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀、物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。会导致设备及附件渗漏。由于操作、设备结构、安装及其他人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位，而不能达到彻底灭菌的目的。生产上常把这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”。第三十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期日防治措施盘管：仔细清洗，检查渗漏，及时发现及时处理，杜绝污染。空气分布管：采取频繁更换空气分布管和认真洗涤等措施。发酵罐体：采取罐内壁涂刷防腐材料、加强清洗并定期铲除污垢、加强罐体清洗等措施。管道：采取合理的管道安装、配置，减少“死角”染菌。第三十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期日四、发酵染菌后的措施染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其他罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。第三十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期日五、噬菌体污染及其防治发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。第四十页，共五十三页，编辑于2023年，星期日①具有非常专一的寄生性。②不耐热性。③pH的稳定性。④嗜氧性。⑤对干燥的稳定性⑥不耐药性（一）、谷氨酸噬菌体的主要特征第四十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期日染噬菌体表现为（氨基酸发酵）：1、镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。2、发酵pH值逐渐上升，4~8h之内可达8.0以上，不再下降。3、发酵液残糖高，粘度大，泡沫多。4、生产量甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验第四十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期日（二）产生噬菌体的原因通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害，经过1～2年以后，主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也携带着噬菌体到处传播，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐。第四十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期日（三）染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入20％～30％培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，观察有无透明圈出现。第四十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期日（四）噬菌体的防治

1、严格活菌体的排放，切断噬菌体的“根源”２、做好环境卫生，消灭噬菌体和杂菌。３、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌，严防噬菌体和杂菌进入种子罐和发酵罐。４、抑制罐内噬菌体的生长。噬菌体的防治是一项系统工程，具体归纳以下几点：第四十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期日（五）、发酵罐中污染噬菌体后的抢救A、并罐法利用噬菌体只能在处于生长繁殖期细胞中增值的特点，当发现发酵罐初期污染噬菌体时，可采取并罐法。即将其他罐批发酵16~18h小时左右的发酵液，以等体积混合后分别发酵，利用其活力旺盛的种子，不进行加热灭菌，亦不需另行补种，便可正常发酵。B、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种发现噬菌体后停搅拌、小通风，降低pH值，立即培养要轮换的菌种或抗性种子，培养好后接入发酵罐，并补加1/3正常量的玉米浆、磷盐和镁盐。第四十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期日C、放罐重消法发现噬菌体后，放罐，调pH值，补加1/2正常量的玉米浆和1/3正常量的水解糖，适当降低温度重新灭菌，接入2%的种子，继续发酵。D、罐内灭噬菌体法：发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70~80℃杀死噬菌体。冷却后，接种发酵。（五）、发酵罐中污染噬菌体后的抢救第四十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期日小结染菌对发酵的危害：造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量第四十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期日染菌原因设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善染菌后的措施发酵液必须灭菌后才可放下水道寻找染菌的原因染菌厉害时，车间环境