第一章分光光分析

学习要求1、掌握紫外-可见分光光度分析的特点、基本原理、测定条件的选择、测定实验技术、定性和定量分析方法及有关术语。2、掌握紫外-可见分光光度计的结构，使用、维护和保养方法。当前第1页\共有55页\编于星期五\7点基于物质光学性质而建立起来的分析方法称之为光学分析法，分为:光谱分析法和非光谱分析法（如比色法、旋光测定法）。

光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。

光学分析法概述当前第2页\共有55页\编于星期五\7点在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法，按所用光的波长不同分为:原子吸收光谱：利用物质的气态原子对特定波长的光的吸收来进行分析的方法。

红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m（红外光区），主要用于有机化合物结构鉴定和定量分析。

紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。

可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400760nm（可见光区），主要用于有色物质的定量分析。本章主要讲授紫外-可见吸光光度法。主要光谱分析法当前第3页\共有55页\编于星期五\7点第一节分光光度分析的基本原理1、物质对光的选择性吸收

光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述：

=c；波数=1/=/c光是由光子流组成，光子的能量：

E=h=hc/

（h=6.626×10-34J·Sh---Planck常数)光的波长越短（频率越高），其能量越大。一、朗伯-比耳定律1.1光的特性当前第4页\共有55页\编于星期五\7点白光（400-760nm，日光、白炽灯光等）是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。可见光波谱单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成)。当前第5页\共有55页\编于星期五\7点白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。黄绿青橙白光青蓝红紫红蓝互补色光示意图当前第6页\共有55页\编于星期五\7点当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。物质吸收黄光，透过蓝光：CuSO4吸收黄光，显蓝色。物质吸收蓝光，透过黄光互补光:蓝光和黄光1.2物质的颜色当前第7页\共有55页\编于星期五\7点2、透射比(透过度、透光率)T和吸光度（T：0~1）透射比T:描述入射光透过溶液的程度。吸光度A与透光率T的关系:A＝－lgT当前第8页\共有55页\编于星期五\7点布格尔(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：A∝l

1852年，比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：A∝c

综合考虑，即一束平行单色光通过有色溶液，溶液的吸光度与溶液的浓度和厚度成正比。

3、朗伯—比耳定律当前第9页\共有55页\编于星期五\7点

A＝lg（I0/It)=klc

A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度；

l：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的浓度，单位g·L-1

k：吸光系数，单位L·g-1·cm-1

朗伯—比耳定律数学表达式吸光系数k(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。当前第10页\共有55页\编于星期五\7点A＝lg（I0/It)=εlc

式中

c：溶液的物质的量浓度，单位mol·L-1；

ε：摩尔吸光系数，单位L·mol-1·cm-1；ε与k的关系为：

k=ε/M（M为摩尔质量）

4、摩尔吸光系数摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。摩尔吸光系数是物质吸光能力的量度，可作为定性分析的参考。其值越大，方法的灵敏度越高。当前第11页\共有55页\编于星期五\7点

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；吸收定律的适用条件1．必须是使用单色光为入射光；2．溶液为稀溶液；3．吸收定律能够用于彼此不相互作用的多组分溶液。它们的吸光度具有加合性，且对每一组分分别适用，即：

A总=A1+A2+A3…+An=k1lc1+k2lc2+k3lc3…+knlcn4．吸收定律对紫外光、可见光、红外光都适用。当前第12页\共有55页\编于星期五\7点标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。5、偏离朗伯—比耳定律的因素当前第13页\共有55页\编于星期五\7点（1）单色光不纯引起的偏离实际上，分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。（2）介质不均匀引起的偏离当溶液中含有悬浮物或胶粒等散射质点时，入射光通过溶液时就会有一部分光因散射而损失掉，使透过光强度减小，测得的吸光度增大，从而引起偏离吸收定律。当前第14页\共有55页\编于星期五\7点（3）与测定溶液有关的因素朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用。这只有在稀溶液(c<0.01mol/L)时才基本符合，当溶液浓度较高时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。当前第15页\共有55页\编于星期五\7点分光光度法主要应用于测试样中微量组分，与滴定分析、重量分析法相比，有如下特点：1、灵敏度高下限一般可达10-4-10-7g/mL2、准确度高相对误差1-3%3、操作简便4、测定快速5、有一定的选择性6、仪器简单二、分光光度法的特点及应用当前第16页\共有55页\编于星期五\7点例题：已知某化合物的相对分子量为251，将此化合物用已醇作溶剂配成浓度为0.150mmol/L溶液，在480nm处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数和吸光系数。解：已知溶剂浓度c=0.150mmol/L，l=2.00cm,T=0.398,由Lambert-Beer定律得：

ε（480nm）=A/cl=-lg0.398/0.150×10-3×2.00=1.33×103(L·mol-1·cm-1)由ε=kM,得K=ε/M=ε/251=5.30(L·g-1·cm-1)当前第17页\共有55页\编于星期五\7点第二节分光光度分析的样品前处理固体样品：干法消化、湿法消化、溶剂萃取液体样品：消除干扰物质（离子）当前第18页\共有55页\编于星期五\7点第三节分光光度分析的条件选择控制溶液吸光度在0.2-0.7之间。一、试样浓度控制方法：1）控制溶液浓度A>0.7时，稀释后测量；A<0.2时，扩大取样量或浓缩后测量。2）控制液层厚度A>0.7时，选择光程小的吸收池；A<0.2时，选择光程大的吸收池。

当前第19页\共有55页\编于星期五\7点吸收曲线的讨论（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。二、测定波长的选择当前第20页\共有55页\编于星期五\7点(5)在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。(3)吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。(4)不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。当前第21页\共有55页\编于星期五\7点当前第22页\共有55页\编于星期五\7点显色反应----被测组分和某种试剂反应后生成有色物质的反应。通过显色反应，可以加深被测组分的颜色。显色反应的灵敏度用摩尔吸收系数ε表示。ε

>105：超高灵敏；

(6～10）×104：高灵敏；<2×104：不灵敏。三、显色条件的选择当前第23页\共有55页\编于星期五\7点灵敏度高---εmax最大；选择性好---显色剂只与被测物质反应。有色化合物组成固定---有定量关系。显色产物稳定---便于测定。1、显色剂的选择无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。有机显色剂：种类繁多。偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等当前第24页\共有55页\编于星期五\7点

吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的情况。2、显色剂用量对一系列浓度相同的试液，加入不同量的显色剂，分别测定其吸光度，如果在某一浓度范围内所测得的吸光度不变，就可以在此范围内确定显色剂的用量。显色反应的速度有快有慢，快的几乎是瞬间完成，颜色很快达到稳定状态，并且能保持较长时间。大多数显色反应的速度是比较慢的，需要一定时间才能达到稳定。而且有些有色化合物放置过久也会褪色。适宜的显色时间要由实验来确定。3、显色时间当前第25页\共有55页\编于星期五\7点1、对溶液中待测组分状态的影响很多高价金属离子都会水解，酸度较低时，不利于显色反应的进行。2、对显色剂本身颜色的影响很多显色剂都是有机弱酸，如果控制不好酸度，就会使指示剂颜色与有色化合物的颜色相近而影响测定。四、pH的选择酸度对显色反应的影响很大，因为溶液酸度直接影响着金属离子、显色剂的存在形式和有色化合物的组成、稳定性等。比如：用二甲酚橙为显色剂，它与金属离子形成的配合物为红色，它本身在pH<6.3时为柠檬黄色，而在PH＞6.3时为红紫色。所以在pH＞6.3时，就无法进行测定。当前第26页\共有55页\编于星期五\7点3、对显色剂反应的影响许多显色反应是配位反应，伴随酸效应，故酸度对显色反应影响较大。在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。一般显色反应在室温下进行，但是也有一些反应要加热到一定温度下才能进行。而且还有一些有色配合物在室温下会分解。五、温度的选择当前第27页\共有55页\编于星期五\7点

选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。例：测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为Fe2+，消除Fe3+的干扰。1、控制酸度2、加入掩蔽剂3、选择合适的条件（浓度、波长）4、分离干扰离子六、干扰离子的影响及清除方法当前第28页\共有55页\编于星期五\7点

参比溶液用来调节仪器的零点，并可以消除某些比色分析的误差，测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。

参比溶液的选择一般遵循以下原则：⑴若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；⑶若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；⑷若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。七、选择合适的参比溶液当前第29页\共有55页\编于星期五\7点第四节分光光度计的基本构造和使用流程一、基本构造光源单色器吸收池检测器显示0.575光源单色器吸收池检测器显示当前第30页\共有55页\编于星期五\7点1、光源----有热辐射光源和气体放电光源两类要求：在可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在350～1250nm。它是比色计和分光光度计的光源。紫外区：氢、氘灯。发射150～400nm的连续光谱。它是紫外分光光度计的光源。仪器自动控制或手动选择单色光波长。当前第31页\共有55页\编于星期五\7点常用的色散元件有棱镜和光栅两种。棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350~3200nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185~4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光区。光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。2、单色器单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的光波且波长在紫外可见区域内任意可调。通常由准直镜（聚光镜）、色散元件、狭缝组成。当前第32页\共有55页\编于星期五\7点样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。（注意；每次使用要清洗干净，或者润洗。）3、吸收池当前第33页\共有55页\编于星期五\7点利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。4、检测器光电池----用半导体材料制成的光电转换器。用得最多的是硒光电池。当前第34页\共有55页\编于星期五\7点光电管的工作原理---将光强度信号转换成电信号当一定强度的光照射到阴极上时，光敏物质要放出电子，放出电子的多少与照射到它的光的大小成正比，而放出的电子在电场的作用下要流向阳极，从而造成在整个回路中有电流通过。而此电流的大小与照射到光敏物质上的光的强度的大小成正比。这就是光电管产生光电效应的原理。光电倍增管----非常灵敏的光电器件，可以把微弱的光转换成电流。其灵敏度比前2种都要高得多。它是利用二次电子发射以放大光电流，放大倍数可达到108倍。当前第35页\共有55页\编于星期五\7点5、信号指示系统（检流计、数字显示或自动记录装置）很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。当前第36页\共有55页\编于星期五\7点二、分光光度计类型1、简易分光光度计721型分光光度计722型分光光度计当前第37页\共有55页\编于星期五\7点2、紫外-可见分光光度计当前第38页\共有55页\编于星期五\7点紫外分光光度法-----利用被测物质的分子、离子以及有机化合物中的官能团（主要为具有不饱和键和未成对电子的基团。如：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—）对紫外光选择性吸收的特性而建立起来的方法。当前第39页\共有55页\编于星期五\7点1、光源

钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm。氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm。当前第40页\共有55页\编于星期五\7点2、吸收池玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区。石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）当前第41页\共有55页\编于星期五\7点3、单色器色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同分出光波长（不等距）。光栅——衍射和干涉分出光波长（等距）。4．检测器将光信号转变为电信号的装置。光电池、光电管（红敏和蓝敏）、光电倍增管、二极管阵列检测器。当前第42页\共有55页\编于星期五\7点三、仪器使用基本流程1、检查仪器停止状态2、接通电源，打开仪器开关3、调节波长

稳定约20min4、仪器调零和调满5、选择合适的吸收池、参比溶液6、试样放入7、测量、读数、记录8、关机当前第43页\共有55页\编于星期五\7点第五节分光光度分析方法二、定量分析方法一、定性分析方法1、标准曲线法2、比较法3、增量法（标准加入法）4、示差法当前第44页\共有55页\编于星期五\7点测量有色溶液的吸光度后，常用工作曲线或比较法确定其浓度。1、标准曲线法

绘制A-C工作曲线配制一系列不同含量的待测组分的标准溶液，以不含待测组分的空白溶液为参比，测定标准溶液的吸光度。并绘制吸光度—浓度曲线，得到标准曲线（工作曲线），然后再在相同条件下测定试样溶液的吸光度。由测得的吸光度在曲线上查得试样溶液中待测组分的浓度，最后计算得到试样中待测组分的含量。此法适合所测吸光度皆在0.2-0.7范围内的有色溶液当前第45页\共有55页\编于星期五\7点0.710mg/25mL芦丁含量测定：取样品3mg稀释至25mL。当前第46页\共有55页\编于星期五\7点2、比较法

同一强度的单色光，通过两个厚度相同而浓度不同的有色溶液时，则两溶液浓度之比等于其吸光度之比。若标准溶液的浓度是已知的，通过计算，可以得到试样的浓度。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs。则：

Ax=εb

cx

As=εbcs得：Ａx/Ａs=εbcx/εb

cs=cx/cs此法适用于所测溶液浓度与标准溶液浓度相近时当前第47页\共有55页\编于星期五\7点把未知试样溶液分成体积相同的若干份，除其中的一份不加入待测组分的标准物质外，在其它几份中都分别加入不同量的标准物质。然后测定各份试液试液的吸光度并绘制吸光度对加入的标准物质的浓度（增量）作图，得一标准曲线：由于每份溶液中都含有待测组分，因此，标准曲线不经过原点。将标准曲线外推延长至与横坐标交于一点，则此点到原点的长度所对应的浓度值就是待测组分的浓度。3、增量法（标准加入法）此法的优点是：自动扣除背景吸收当前第48页\共有55页\编于星期五\7点y2=k(x+x0)+bx0xy当前第49页\共有55页\编于星期五\7点普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。

设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs<cx)。则：

Ax=εbcx

As=εbcsΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx－