构建质粒 重组质粒的构建

构建质粒重组质粒的构建

构建质粒篇一:学会构建质粒这一招，你可以靠卖质粒发家致富啦！

你是否曾遇到这样的问题，老板让你讨论一个新的基因，你需要用到这个基因的质粒，可是试验室没有师兄师姐讨论过，所以光靠换载体这点技能已经不足以让你构建出你所需要的质粒了，然而公司的报价特殊高，一千两千还是廉价的，甚至还有报价上万的质粒，并且货期很长，老板督促你要结果，或者不情愿花那么多钱给你买质粒，这时候你该怎么办？今日教的这一招，你以后都可以自己动手从零开头构建质粒啦。

构建质粒，最重要的是两样东西，一个是这个基因的CDS片段，另一个是空载，对于常做分子克隆的试验室，空载是确定有的啦，没有的话去隔壁试验室借一点也是没问题的，所以问题的重心就是CDS片段怎么来！！

RNA大家都提取过吧，做QPCR之前要先从处理过的细胞中提取RNA，然后逆转录成CDNA。想到了吧，我们的CDS片段就可以从这一堆CDNA里挑出来，我们用来构建质粒的CDNA与用来做QPCR的CDNA唯一的不同在于，我们逆转录用的酶不一样，在这里给大家推举一款：

全式金的AT321

TransScriptTM

II

All-in-One

First-Strand

cDNASynthesis

SuperMix

for

PCR

用你手上有的细胞提取RNA，接着用此酶进行逆转录获得CDNA，之后就可以用这个CDNA作为模板来进行后面的试验了。有时候可能在某个细胞株中你所需要的基因恰好是有突变的，这时候你可以换个细胞株试试，也可以尝试把突变的地方再突变回来。

接着我们以KLF4基由于例来构建质粒：

1、首先在PUBMED中找到KLF4的CDS序列，在GENE中搜寻KLF4，选择HOMO，点击进入

2、进入下面这个页面之后，始终往下拉，

3、拉到这个位置，选择自己需要的转录本，在这里我选择第一个，点击进入

4、页面如下，往下拉，观察CDS，点击CDS可以使此基因的CDS序列显示为高亮文本，如图

5、为了可以完整的把CDS序列P出来，所以我们的引物应当设计在高亮文本以外的区域，打开Primer-BLAST来设计引物

6、将刚才查到的全部的序列复制粘贴入输入框中，输入引物的范围，产物的大小，最小为CDS的长度，最大为贴入这段序列的长度

7、点击GETPrimers

8、选择一对副产物少的引物就好了

9、引物合成后，就可以以CDNA为模板P出你想要的片段了。PCR结束之后跑DNA胶，看产物大小是否正确，若正确，进行切胶回收，便可进行下一轮的PCR。

10、其次次PCR使用的引物设计方法就跟换载体那种构建质粒的方法一样啦（同源重组法或者T4连接法都可以），不同的地方是，换载体的时候，我们使用的模板是已有我们基因序列的质粒，在这里我们使用的是第九步中的PCR产物。

11、在第十步中得到的PCR产物切胶回收后，再与酶切好的载体连接，之后做转化，长出克隆后进行测序，测序胜利之后就大功告成了。

策到这，相信大家已经把握这项新技能了吧！抓紧试一试，然后发家致富吧！

构建质粒篇二:两大方法帮你搞定质粒构建

质粒构建是分子生物学讨论中最常用的试验技术。原理依靠于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。下面我就总结一下T4连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。

壹

一.

T4DNALigase即T4DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为帮助因子。

1.质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推举使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

[可选酶切体系]

VECTOR

3ug

CutSmartBuffer

5ul

限制性内切酶1

1ul

限制性内切酶2

1ul

酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37°C孵育6~8小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

2.依据目的序列构建引物后，引物设计原则简洁总结一下:

（1）前向引物：5’端-爱护碱基序列+限制性内切酶1酶切位点序列+基因正向引物序列-3’端

（2）反向引物：5’端-爱护碱基序列+限制性内切酶2酶切位点序列+基因反向引物序列-3’端

假如目的基因片段较长的话，可以选择PCR方式扩增目的基因片段

[可选

PCR

扩增体系]

ddH2O：14ul

10xTaqbuffer：2ul

10umDNTP：1ul

10umprimerF：0.5ul

10umprimerR：0.5ul

模板DNA：1ul

Taq

酶：1ul

[可选

PCR

扩增条件]

(1)95℃：5min

(2)35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火温度可以依据目的引物TM值打算，一般退火温度根据引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入爱护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。

3.载体与目的基因的连接，推举在

10~20μl

反应体系中进行接反应。

[可选连接体系]

载体

25ng

退火产物

2ul

10xT4buffer

1ul

T4DNAligase

1ul

T4连接酶一般选择4度过夜

4.转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培育过夜。

5.挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培育，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

贰

下面开头重点介绍重组酶构建质粒，基于同源基因重组原理，适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆50bp～10kb片段，同时构建时间也大大缩短。

1.载体的制备一般推举双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。酶切体系同上。

2.对于使用重组方式连接来说，PCR要设计引物,设计引物时要依据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过PCR扩增方式进行连接，PCR的产物要纯化。

引物设计原则简洁总结一下：

（1）前向引物：5’端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’端

（2）反向引物：3’端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’端

假如设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长，可以选择PCR方式进行目的引物的扩增。

[可选

PCR扩增体系]

ddH2O

14ul

10xTaqbuffer

2ul

10umDNTP

1ul

10umprimerF

0.5ul

10umprimerR

0.5ul

Vector

1ul

Taq酶

1ul

[可选

PCR扩增条件]

(1)95℃：5min

(2)35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火温度可以依据目的引物TM值打算，一般退火温度根据引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

PCR扩增后，通过胶回收方式获得纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物不需要进行酶切，直接用于重组反应。

3.目的引物与线性载体进行重组反应。

[可选重组体系]

5×CEIIBuffer

4μl

线性化克隆载体

50～200ng

插入片段扩增产物

20～200ng

Exnase®

II

2μl

ddH2O

xul

在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于37℃反应30min。待反应完成后，马上将反应管置于冰水浴中冷却5min。重组效率在反应30min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率，这样大大削减了连接时间。

4.转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培育过夜。

5.挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培育，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

最终，几个主要留意事项：

1.载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且GC含量比较匀称的区域进行克隆。当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，克隆效率将达到最大.

2.最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量=[0.02×克隆载体碱基对数]ng（0.03pmol）

最适插入片段使用量=[0.04×插入片段碱基对数]ng（0.