羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程

羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程范围本标准规定了羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测方法的技术规范。

本标准适用于羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施术语和定义下列术语和定义适用于本文件。一抗酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与包被的抗原结合的抗体称为一抗。阴阳性血清和待检血清统称为一抗。二抗酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与一抗结合的抗抗体称为二抗。本标准中兔抗羊IgG抗体为二抗。试剂或材料产气荚膜梭菌使用A型产气荚膜梭菌标准株CVCC41。产气荚膜梭菌阳性血清羊经免疫产气荚膜梭菌抗原3次后获得的血清，每次免疫间隔两周。抗体中和试验检测效价高于1:256（附录A）。阴性血清从健康的未感染未免疫的羊分离的血清（附录A）。生化试剂灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCL、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录B）；PCRbuffer；dNTP；Taq聚合酶；溴酚蓝；二甲苯青；蔗糖；Tris-乙酸；乙二胺四乙酸（EDTA）；溴化乙锭；X脂糖；Tween-20；考马斯亮蓝G-250；考马斯亮蓝R-250；邻苯二胺（OPD）；30%丙烯酰胺；十二烷基硫酸钠（SDS）；过硫酸铵（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；甲醛溶液；FT培养基；产毒培养基；酵母浸膏粉；蛋白胨；L-精氨酸；糊精。水试验用水符合GB/T6682三级水的规定。仪器设备微量移液器：量程为20μL～100μL。PCR管：200μL体积。灭菌吸管：1.0mL。恒温培养箱。匀速振荡器。离心机：转速不低于16000r/min。96孔ELISA酶标板。PCR仪。酶标仪：波长范围340nm～850nm。分光光度计。玻璃比色皿。产气荚膜梭菌PCR检测方法本检测方法在200μL的离心管中进行，所使用的引物如下：产气荚膜梭菌PCR引物序列PrimersPrimersequence（5’-3’）Size（bp）CPA-FTATGAATGGCAAAGAGGA589CPA-RACTAAAATACTGACCTTC所用的上样缓冲液为：质量/体积比为0.25％的溴酚蓝，质量/体积比为0.25%的二甲苯青，质量/体积比为40%的蔗糖水溶液。所用的含溴化乙锭的X脂糖凝胶为由0.04M的Tris-乙酸和0.001M的乙二胺四乙酸（EDTA）组成的TAE缓冲液配制的，其中含0.5μg/mL的溴化乙锭和质量/体积比为1.5%X脂糖。试验步骤如下：将过夜培养的病原菌，采用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提细菌的基因组DNA；以上述细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体系（50μL）为：10×PCRbuffer（含Mg2+）5.0μL、2.5mmol/LdNTP4.0μL、Taq聚合酶0.3μL、模板为2.0μL、引物浓度为10pmol/μL，用补齐至50μL；PCR扩增反应条件为：预变性94℃7min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；产物末端72℃延伸10min；PCR扩增产物加入上样缓冲液后，再加样于含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5％X脂糖凝胶中，进行X脂糖凝胶电泳检测。结果判定紫外成像仪下观察PCR产物凝胶电泳，如果出现589bp的目的条带（如图1），则判定为产气荚膜梭菌。PCR目的条带图示M代表DNAMarker；1，2，3，4代表检测样本。ELISA检测方法包被包被：将产气荚膜梭菌α毒素蛋白用包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释成10μg/mL，包被酶标板。封闭用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1%BSA的PBS）200μL，置于湿盒内，4℃封闭过夜。一抗孵育用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释羊抗产气荚膜梭菌α毒素高免血清作为阳性对照（制备方法见附录B），取1孔加入1:10倍稀释的羊阴性血清作为阴性对照（制备方法见附录B）；其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37℃作用60min。抗体稀释液为1℅BSA的PBS。二抗孵育用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG（抗体稀释液为1℅BSA的PBS），置湿盒内37℃作用45min。底物显色用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37℃避光显色20min。读数最后用2.0mol/L的H2SO4溶液终止反应，以酶标仪检测样品的OD490值。结果判定以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。

（资料性附录）

羊产气荚膜梭菌α毒素的提取和抗血清的制备羊产气荚膜梭菌α毒素蛋白的提取将保存的羊A型产气荚膜梭菌标准株（CVCC41）接种于200mLFT培养基中进行增菌，37℃厌氧培养12h。将增菌液以5%的比例接种到产毒培养基（配制方法见附录A）中，43℃厌氧培养5h-6h进行产毒。产毒结束，离心（12000r/min，30min）取上清，离心后用0.22µm的滤器过滤取上清。将过饱和硫酸铵溶液缓慢加入到上述所制得上清中，使其终浓度达到40%，4℃静置过夜。离心（10000r/min，20min）保留沉淀，用同体积的含2%TritonX-100的Tris-MgCL2缓冲液溶解。溶解完成后，向管内加入过饱和硫酸铵溶液使其终浓度为40%，再次离心方法同上，最后取3.0mL0.05M的Tris-HCL缓冲液（PH=7.5）溶解沉淀。羊产气荚膜梭菌α毒素蛋白含量测定采用Bradford方法，具体操作步骤如下：取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL，然后用无离子水补充到0.1mL；最后各试管中分别加入5.0mL考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（不能太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）；加完试剂2min-5min后，即可开始用玻璃比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mL水加5.0mL考马斯亮兰G-250试剂。比色皿使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡；用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.50。微量法：当样品中蛋白质浓度较稀时（10mg/mL-100mg/mL），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5mL或1.0mL，空白对照则分别为0.5mL或1.0mL水，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0mL，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.29。羊产气荚膜梭菌α毒素聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）检测聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）采用解离非连续缓冲系统垂直板电泳。使用浓缩胶为5%，分离胶为12%的不连续聚丙烯酰胺凝胶（附录B）。电泳结束，采用考马斯亮蓝R-250染色，以标准低蛋白分子量的对数值和电泳迁移率绘制标准曲线，求出各蛋白分子量。产气荚膜梭菌α毒素抗血清的制备将甲醛缓慢的加入到含有α毒素的溶液中使甲醛终浓度达到0.3%，混匀后，在37℃条件下将外毒素灭活96h，期间每隔5h-6h振荡一次混合液。将灭活的羊产气荚膜梭菌α毒素蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备羊产气荚膜梭菌α毒素免疫用抗原。选取15kg左右的健康未感染未免疫的羊2只，肌肉注射免疫α毒素抗原，共免疫3次，每次间隔2周，α毒素免疫剂量为10mg/只/次。饲养环境饲养符合GB14925《实验动物环境及设施》国家标准的要求。最后1次免疫后7d采血，抗体中和试验检测血清中羊抗羊产气荚膜梭菌α毒素抗体的效价，效价高于1：256以上时采血，分离血清，-20℃保存备用。阴性血清制备采集健康未感染过产气荚膜梭菌的羊，制备阴性血清。

（规范性附录）

溶液的配制灭菌0.5%石炭酸生理盐水的配制称取9.0g氯化钠（NaCl）溶于水，定容到1.0L，再加入5.0mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使用。磷酸盐缓冲液（PBS）的配制1mol/LPBS（pH7.2）的配方如下：氯化钠（NaCL）：8.0g；氯化钾（KCL）：0.2g；磷酸氢二钠（Na2HPO4）：1.44g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：0.24g；加水900mL，调pH等于7.2，定容至1000mL。PBST缓冲液的配制1.0LPBS+1.0mLTween-20。牛血清白蛋白（BSA）将100mg的牛血清白蛋白加入9.5mL水中（须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10mL，然后分装成小份，贮存于-20℃。Tris-HcL缓冲液的配制配方如下：Tris碱：121.1g；浓盐酸（1mol/LHCl）：42.0mL；水：定容至1000mL。在900mL水中加入121.1gTris碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH值至8.0，然后定容至1000mL，分装后高压蒸汽灭菌30min，室温保存。5%浓缩胶配制配方如下：水：2.1mL；30%丙烯酰胺：0.5mL；1.0MTris-HCLbuffer：0.38mL；10%SDS：0.03mL；10%过硫酸铵（AP）：0.03mL；TEMED：0.003mL。12%分离胶配制配方如下：水：1.65mL