药物分析 第11章 抗菌药物与抗生素类的分析1

第十一章抗菌药物与抗生素类药物的分析第一节喹诺酮类抗菌药物的分析

一、结构与性质（一）基本结构与代表药物

吡哌酸诺氟沙星

环丙沙星氧氟沙星

氟罗沙星依诺沙星

司帕沙星（二）性质

1.酸碱两性2.不稳定性

3.有机氟化物的反应

4.紫外与红外吸收光谱特征二、鉴别试验

（一）化学鉴别法1.与丙二酸的呈色反应

盐酸左氧氟沙星片的鉴别：取本品细粉适量（约相当于左氧氟沙星10mg），置干燥具塞试管中，加丙二酸约10mg与醋酐0.5ml，在水浴中加热5~10分钟，溶液显红棕色。2.盐酸盐与甲磺酸盐的鉴别Ch.P.甲磺酸培氟沙星的鉴别：取本品约30mg，加氢氧化钠0.2g，加水数滴，溶解后置酒精灯上小火蒸干至炭化，加水数滴与2mol/L盐酸溶液3～4ml，缓缓加热，即产生二氧化硫气体，能使湿润的碘酸钾淀粉试纸（取滤纸条浸入含有5%碘酸钾溶液与淀粉指示液的等体积混合液中湿透后，取出干燥，即得）显蓝色。（二）光谱法（三）色谱法三、特殊杂质检查

（一）溶液澄清度的检查（二）吸光度喹诺酮类药物在可见光区无吸收，通过控制在420～450nm波长处的吸光度，以控制有色杂质的限量。

司帕沙星中吸光度的检查：取本品，精密称定，加0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含0.4mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在440nm的波长处测定吸光度，不得过0.15。（三）有关物质HPLC（四）光学异构体左氧氟沙星中光学异构体的检查：

取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取适量，用流动相定量稀释制成每1ml中约含10g的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法（附录VD）测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以硫酸铜D-苯丙氨酸溶液（取D-苯丙氨酸1.32g与硫酸铜1g，加水1000ml溶解后，用氢氧化钠试液调节pH值至3.5）-甲醇（82∶18）为流动相；柱温40℃，检测波长为294nm。取氧氟沙星对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，右氧氟沙星与左氧氟沙星依次流出，右、左旋异构体峰的分离度应符合要求。取对照溶液20µl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中右氧氟沙星峰面积不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。（五）残留溶剂（六）防腐剂

Ch.P.盐酸环丙沙星滴眼液采用HPLC法检查防腐剂苯扎溴铵或羟苯乙酯，规定供试品中如含苯扎溴铵或羟苯乙酯，应为标示量的80%～120%；氧氟沙星滴眼液亦采用HPLC法检查防腐剂苯扎溴铵，规定供试品中如含苯扎溴铵，应为标示量的80%～120%。诺氟沙星滴眼液除采用HPLC法检查防腐剂羟苯甲酯、羟苯丙酯外，还采用双硫腙滴定法检查硫柳汞。四、含量测定

（一）非水碱量法（二）紫外分光光度法诺氟沙星乳膏的含量测定：

精密称取本品适量（约相当于诺氟沙星5mg），置分液漏斗中，加三氯甲烷15ml，振摇后，用氯化钠饱和的0.1%氢氧化钠溶液25ml、20ml、20ml和10ml分次提取，合并提取液，置100ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，用0.4%氢氧化钠溶液定量稀释制成每1ml中约含5g的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录IVA），在273nm的波长处测定吸光度；另取诺氟沙星对照品适量，精密称定，加0.4%氢氧化钠溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含5g的溶液，同法测定，计算，即得。（三）高效液相色谱法

本类药物的测定多采用离子抑制色谱法或离子对色谱法。抗生素概述一、抗生素药物的特点

抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。（一）抗生素的来源1.微生物发酵（主要）2.化学合成或半合成（二）抗生素类药物的特点

2.稳定性差3.化学纯度较低

1.多组分及活性组分易发生变异（一）鉴别试验

1.理化法（1）化学法（2）仪器分析法

2.生物学法二、抗生素类药物分析的特点

对照品法1.影响药物纯度的项目溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、吸光度等。2.影响药物稳定性的项目酸碱度、水分等。3.影响药物有效性的项目结晶性、异构体的相对含量、多组分抗生素的组分分析等。（二）检查4.影响药物安全性的项目细菌内毒素、无菌、可见异物、不溶性微粒、β-内酰胺类抗生素中的高分子聚合物、四环素类抗生素中的降解产物等。5.其他检查项目如注射用普鲁卡因青霉素还规定了悬浮时间与抽针试验等。青霉素钠Ch.P.结晶性酸碱度溶液的澄清度与颜色吸光度有关物质青霉素聚合物干燥失重可见异物不溶性微粒细菌内毒素无菌（三）含量测定方法1.抗生素微生物检定法药典附录测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点与临床要求一致灵敏度高、用量少适用范围广，可用于未知药物缺点操作繁琐、测定时间长、测定误差大2.理化方法以理化方法测定抗生素的效价适用于纯度较高的结构确定的抗生素优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价缺点2.易受杂质干扰三、分类4.按化学结构和性质分类3.按作用机制分类2.按抗菌谱分类1.按产生菌分类β－内酰胺类

多烯大环类氨基糖苷类

多肽类四环素类苯烃胺类大环内酯类蒽环类

第二节-内酰胺类抗生素的分析

青霉素类

***氨苄西林（钠）普鲁卡因青霉素头孢菌素类

**一、结构与性质

（一）结构

1.青霉素类（1）侧链（RCO-）+母核（6-APA）（2）分子中含三个手性碳原子（C3、C5、C6）（3）C3位有游离羧基

2.头孢菌素类（1）侧链（RCO-）+母核（7-ACA）（2）分子中含二个手性碳原子（C6、C7）（3）C4位有游离羧基（二）性质

1.酸性青霉素和头孢菌素分子中有游离羧基有酸性，大多数青霉素类药物的pKa在2.5～2.8之间，能与碱反应形成盐。2.溶解性

游离的β-内酰胺类抗生素不溶于水，其碱金属盐易溶于水，遇酸析出白色沉淀；而有机碱盐难溶于水，易溶于有机溶剂。3.旋光性4.紫外吸收光谱特征（1）青霉素分子的母核无吸收，侧链有吸收（2）头孢菌素分子的母核有吸收

5.-内酰胺环的不稳定性

-内酰胺环不稳定，与酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子等作用，易发生水解和分子重排，导致失去抗菌活性

二、鉴别试验（一）化学鉴别法1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类呈色Fe3+H+头孢哌酮Ch.P.取本品约10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液[取34.8%盐酸羟胺溶液1份，醋酸钠-氢氧化钠溶液（取醋酸钠10.3g与氢氧化钠86.5g，加水溶解使成1000ml）1份，乙醇4份，混匀]3ml，振摇溶解后，放置5分钟，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。2.与三氯化铁反应3.茚三酮反应4.K+、Na+的焰色反应1.UV2.IR

β－内酰胺环环张力较大，所以羰基的伸缩振动增强而且向高波数位移（二）光谱法氯唑西林钠Ch.P.取本品约30mg，加甲醇0.1ml使溶解，滴入蒸发皿上，待甲醇自然挥发完后，真空干燥，按红外分光光度法测定，其红外光吸收图谱应与同法处理的氯唑西林钠对照品的图谱一致。3.NMR头孢氨苄的鉴别

取本品，溶于重水（1/200），以3-三甲基硅烷基丙烷磺酸钠为内参比物，测定核磁共振光谱（1H）。在δ=1.8附近应显示单一信号A，δ=7.5附近应显示单一或尖锐的多重信号B。各信号的积分强度比（A∶B）约为3∶5。头孢羟氨苄的磁共振光谱（1H）。在δ=2.1附近应显示单一信号A，δ=7.0附近应显示双单一信号B和δ=7.5附近应显示双单一信号C。各信号的积分强度比（A∶B∶C）约为3∶2∶2。其中，A为母核C3上甲基氢的信号；B和C为侧链的苯环上氢的信号。（三）色谱法TLCHPLC三、特殊杂质的检查（一）聚合物分子排阻色谱法头孢尼西钠Ch.P.头孢尼西聚合物照分子排阻色谱法（附录ⅤH）测定。色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10（40~120μm）为填充剂；玻璃柱内径为1.0~1.4cm，柱长为30~40cm，流动相A为pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液[0.1mol/L磷酸氢二钠溶液-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（61∶39）]，流动相B为水，流速约为每分钟1.2ml，检测波长为254nm。取0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液100~200μl注入液相色谱仪，分别以流动相A、B进行测定，记录色谱图。理论板数以蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于500，拖尾因子均应小于2.0。在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值应在0.93~1.07之间，对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值均应在0.93~1.07之间。称取头孢尼西钠约0.2g，置10ml量瓶中，用0.1mg/ml的蓝色葡聚糖2000溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。取100~200μl注入液相色谱仪，用流动相A进行测定，记录色谱图。高聚体的峰高与单体和高聚体之间的谷高比应大于2.0。另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液100~200μl，连续进样5次，峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%。对照溶液的制备取头孢尼西对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含头孢尼西0.1mg的溶液。测定法取本品约0.2g，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。立即精密量取100~200μl，注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图。另精密量取对照溶液100~200μl注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含头孢尼西聚合物以头孢尼西计不得过0.4%。（二）有关物质HPLC（三）异构体HPLC

（四）残留溶剂GC

（五）2-乙基己酸GC

（六）吸光度

（七）结晶性

（八）水分（九）其他特殊杂质的检查1.N,N-二甲基苯胺氨苄西林

2.N-甲基吡咯烷

盐酸头孢吡肟中要检查N-甲基吡咯烷，Ch.P.（2010）共收载二法，毛细管电泳法（内标法定量）和高效液相色谱法（外标法定量）。照毛细管电泳法（附录ⅤG）测定。电泳条件与系统适用性试验用内径75μm，有效长度56cm的未涂层弹性石英毛细管；以pH4.7咪唑-醋酸缓冲液（取0.01mol/L咪唑溶液，用1mol/L醋酸溶液调节pH值至4.7）为操作缓冲液；柱温为25℃；检测波长为214nm（间接检测）；操作电压为30kV；进样方法为压力进样（50mbar，5s）。新毛细管应依次用1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L盐酸溶液、乙腈和水分别冲洗处理5分钟。两次进样中间应依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液和操作缓冲液分别冲洗毛细管3分钟。取N-甲基吡咯烷对照品溶液进样，迁移顺序依次为：乙胺和N-甲基吡咯烷，N-甲基吡咯烷峰与乙胺峰的分离度应大于2.0，计算数次进样结果，其相对标准偏差不得过5.0%。测定法精密称取本品约200mg，置10ml量瓶中，加内标溶液（取盐酸乙胺适量，用水稀释成每1ml中约含0.1mg的溶液）溶解并稀释至刻度，摇匀，立即进样，记录电泳图。另精密称取N-甲基吡咯烷约25mg，置50ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，精密量取10ml，置50ml量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法测定。按内标法以峰面积计算，不得过0.3%。3.头孢氨苄头孢拉定

4.头孢孟多头孢孟多酯钠

5.吡啶头孢他啶

特点专属性强一法多用（鉴别、检查、含量测定）HPLC法Ch.P.四、含量测定

Ch.P.氯唑西林钠的含量测定：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（用氢氧化钠试液调节pH值为5.0）-乙腈（75∶25）为流动相；检测波长为225nm。取氯唑西林对照品与氟氯西林对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.1mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，氯唑西林峰与氟氯西林峰之间的分离度应大于2.5。理论板数按氯唑西林峰计算不低于1000，拖尾因子不得过1.5。测定法取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取氯唑西林对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品中C19H18ClN3O5S含量。99：89．下列哪个药物会发生羟肟酸铁反应（A）A.青霉素B.庆大霉素C.红霉素D.链霉素E.维生素C

99x：71．中国药典（1995年版）测定头孢菌素类药物的含量时，多数采用的方法是（E）A.微生物法B.碘量法C.汞量法D.正相高效液相色谱法E.反相高效液相色谱法

95：139．属于-内酰胺类的抗生素药物有（AC）A.青霉素B.红霉素C.头孢菌素D.庆大霉素E.四环素

96：135．青霉素类药物可用下面哪些方法测定（BCD）A.三氯化铁比色法B.汞量法C.碘量法D.硫醇汞盐法E.酸性染料比色法

第三节氨基糖苷类抗生素的分析

一、结构与性质

（一）结构

1.链霉素链霉素分子中有3个碱性中心（1）混合物庆大霉素C的复合物，主要有C1，C2，C1a，C2a2.庆大霉素（2）庆大霉素分子中有5个碱性中心

1.溶解性与碱性多羟基和碱性基团，为碱性、水溶性抗生素，临床应用其硫酸盐，易溶于水，不溶于有机溶剂

2.旋光性（二）性质3.稳定性硫酸链霉素pH5～7.5最稳定，过酸或过碱易水解失效。OH-4.紫外吸收光谱特征链霉素在230nm波长处有紫外吸收

二、鉴别试验

1.茚三酮反应（一）化学鉴别法

硫酸小诺霉素Ch.P.【鉴别】（1）取本品约5mg，加水溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显蓝紫色。

2.葡萄糖胺反应链霉素、庆大霉素

乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色水解例

硫酸新霉素Ch.P.

【鉴别】（1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9→100）2ml，在水浴中加热10分钟，加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色。3.Molisch反应水解蒽酮例

阿米卡星Ch.P.

【鉴别】取本品约10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即显蓝紫色。4.麦芽酚反应链霉素特有

例

硫酸链霉素Ch.P.

【鉴别】（2）取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液（取硫酸铁铵0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解）0.5ml，即显紫红色。5.坂口反应链霉素中链霉胍特有的反应

例

硫酸链霉素Ch.P.

【鉴别】（1）取本品约0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1%8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至约15℃，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。6.硫酸盐的反应（二）光谱法

1.IR2.UV（三）色谱法

1.

TLC2.HPLC三、检查

1.组分测定

庆大霉素C组分的测定

Ch.P（2000）、USP（30）：柱前衍生化离子对反相高效液相色谱法，衍生化试剂为邻苯二醛，离子对试剂为庚烷磺酸钠。

硫酸庆大霉素Ch.P.（2010）

【检查】庆大霉素C组分照高效液相色谱法（附录ⅤD）测定。填充剂十八烷基硅烷键合硅胶(pH0.8~8.0)

流动相0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92:8）检测器蒸发光散射检测器

硫酸庆大霉素C组分的HPLC-ELSD色谱图庆大霉素标准品（A）及其样品（B）的HPLC-ELSD色谱图

1-硫酸盐；2-庆大霉素C1a；3-庆大霉素C2；4庆大霉素C2b；5-庆大霉素C2a；6-庆大霉素C1；7-未知杂质

AB2.有关物质

TLC或HPLC硫酸盐测定（1）EDTA络合滴定法剩余滴定法硫酸小诺霉素中硫酸盐的测定：取本品约0.125g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节pH值至11，精密加氯化钡滴定液（0.1mol/L）10ml及酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定，注意保持滴定过程中的pH值为11，滴定至紫色开始消褪，加乙醇50ml，继续滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml氯化钡滴定液（0.1mol/L）相当于9.606mg硫酸盐（SO4），按无水物计算，含硫酸盐应为32.0%～37.0%。（2）HPLC法硫酸庆大霉素中硫酸盐的测定：精密量取硫酸滴定液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含硫酸盐（SO4）0.075mg、0.15mg、0.30mg的溶液作为对照品溶液（1）、（2）、（3）。照庆大霉素C组分项下的色谱条件试验，精密量取对照品溶液（1）、（2）、（3）各20µl，分别注入液相色谱仪，计算对照品溶液浓度的对数值与相应的峰面积的对数值的线性回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；另精密称取本品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液，同法测定，用线性回归方程计算供试品中硫酸盐的含量。按无水物计算应为32.0%~35.0%。四、含量测定

1.微生物检定法例

硫酸链霉素Ch.P.

【含量测定】精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录ⅪA管碟法或浊度法）测定，1000链霉素单位相当于1mgC21H38N7O12。2.HPLC

（1）蒸发光散射检测

Ch.P.（2010）收载的硫酸卡那霉素、硫酸依替米星采用HPLC法测定含量，蒸发光散射检测器检测。如硫酸依替米星的含量测定：色谱条件与系统适用性条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（pH范围0.8－8.0）；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（84：16）为流动相；流速为每分钟0.5ml；用蒸发光散射检测器检测（参考条件：漂移管温度100℃，载气流速为每分钟2.6L）。取依替米星对照品和奈替米星对照品各适量，用水溶解并定量稀释制成每1ml中各含0.2mg的混合溶液，取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，依替米星峰和奈替米星峰之间的分离度应大于1.2，连续5次进样，依替米星峰面积相对标准偏差应不大于2.0%。测定法：取依替米星对照品适量，精密称定，分别用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含依替米星1.0mg、0.5mg和0.25mg的溶液作为对照品溶液（1）、（2）、（3）。精密量取上述三种溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值对相应的峰面积的对数值计算线性回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；另取本品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含依替米星0.5mg的溶液，同法测定，用线性回归方程计算供试品中C21H43N5O7的含量。（2）紫外检测器检测衍生化Ch.P.（2010）收载的阿米卡星、硫酸阿卡米星采用HPLC法测定含量，采用2,4,6-三硝基苯磺酸为柱前衍生化试剂，选择340nm为检测波长紫外检测器检测。色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.27%磷酸二氢钾溶液（用2.2%的氢氧化钾溶液调节pH值至6.5）-甲醇（30∶70）为流动相；检测波长为340nm。取阿米卡星对照品和杂质A对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中各含100g的混合溶液，精密量取0.2ml至10ml量瓶中，加1.0％的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液2ml、吡啶3ml，密塞，强力振摇30秒，置75℃水浴保温2小时，在冷水中冷却2分钟，加冰醋酸2ml，密塞，强力振摇30秒，用水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。取20μl注入液相色谱仪，阿米卡星峰与杂质A峰的分离度应不小于3.5；理论板数按阿米卡星峰计算不低于3500。测定法

取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，照系统适用性试验溶液的衍生化方法处理，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取硫酸阿米卡星对照品适量，同法测定。按外标