转基因生物反应器

转基因生物反应器第一页，共六十七页，编辑于2023年，星期四2010年5月20日：世界首个人造生命“辛西娅”第二页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第三页，共六十七页，编辑于2023年，星期四《无题》唐李商隐相见时难别亦难，东风无力百花残。春蚕到死丝方尽，蜡炬成灰泪始干。晓镜但愁云鬓改，夜吟应觉月光寒。蓬山此去无多路，青鸟殷勤为探看。蚕的一生经过蚕卵—蚁蚕—熟蚕—蚕茧—蚕蛾，共四十多天的时间第四页，共六十七页，编辑于2023年，星期四家蚕生物反应器将特定的重组杆状病毒（基因）植入家蚕的蚕蛹体内，生成对人类有用的生物活性物质（如生物药品、生物疫苗、保健食品等）。例如：把人胶原蛋白的基因植入蚕的细胞里，培育出绢丝腺分泌人胶原蛋白的转基因蚕。第五页，共六十七页，编辑于2023年，星期四牛：吃的是草，挤出的是奶转基因牛：吃的是草，挤出的是药！/society/2007-05/19/content_6121516.htm第六页，共六十七页，编辑于2023年，星期四/s/blog_4bb17e9d0100mq3q.html第七页，共六十七页，编辑于2023年，星期四本节主要内容1.转基因动物细胞生物反应器2.转基因动物生物反应器——乳腺生物反应器3.转基因植物生物反应器本节关键问题基因工程动物细胞构建技术、高效表达异源蛋白的策略第八页，共六十七页，编辑于2023年，星期四一转基因生物反应器转基因技术（Transgenictechnique）：通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的技术。转基因生物反应器（Transgenicbioreactor）：将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。第九页，共六十七页，编辑于2023年，星期四转基因微生物生物反应器：由于微生物结构简单、繁殖迅速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化获得所需要的目的产物，生产的药物属于第一代基因工程药物。转基因植物细胞生物反应器：将外源基因转入植物细胞，表达制备相关产品。由于植物细胞大规模培养技术限制，目前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定难度。第十页，共六十七页，编辑于2023年，星期四转基因动物细胞生物反应器：将外源基因转入动物细胞，表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。转基因动植物生物反应器：将外源基因转入动植物个体，表达制备相关产品。转基因动植物技术不仅限于转基因技术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因此过程复杂。第十一页，共六十七页，编辑于2023年，星期四二转基因动物细胞生物反应器大多数哺乳动物蛋白翻译后的修饰，例如：糖基化、磷酸化和乙酰化等，是保持生物学活性、稳定性及抗原性的前提。转基因微生物在生产分子量较小、结构较为简单的异源蛋白方面具有优越性，微生物表达系统合成的复杂真核蛋白存在折叠方式不正确、缺乏翻译后加工修饰等缺陷，动物细胞蛋白质表达系统可以较好地解决这些问题。第十二页，共六十七页，编辑于2023年，星期四目的基因导入

电穿孔法显微注射法裸露DNA直接注射磷酸钙—DNA共沉淀法脂质载体包埋法病毒介导的生物学方法第十三页，共六十七页，编辑于2023年，星期四1.转基因方法（1）电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔，达到增加通透性的效果，从而使外源DNA转移至细胞中。简单、效率较高。第十四页，共六十七页，编辑于2023年，星期四利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。(2)显微注射转基因技术第十五页，共六十七页，编辑于2023年，星期四（3）脂质体载体包埋法将需转移的外源DNA或RNA与脂质体混合，带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体内形成DNA-阳离子脂质体复合物。由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。效率高。第十六页，共六十七页，编辑于2023年，星期四（4）逆转录病毒法逆转录病毒是一种整合型的单链RNA病毒。将目的基因重组到反转录病毒载体上，感染细胞。病毒进入细胞后，利用宿主细胞的酶体系自行反转录和复制，从而可以使病毒单拷贝基因组稳定地进入宿主细胞。载体容量小（8KB）。第十七页，共六十七页，编辑于2023年，星期四这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。(5)磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术第十八页，共六十七页，编辑于2023年，星期四2.宿主细胞及筛选在体外能无限生长的细胞作为受体细胞。采用特异性选择标记用于快速有效地筛选转染细胞。例如：胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidinekinase,TK)：当转入TK-细胞时，其基因产物可使宿主细胞获得对HAT培养液的抗性。二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)：缺失DHFR的CHO细胞不能合成四氢叶酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液上生长。转染dhfr基因的缺陷型CHO细胞可在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液上生长。第十九页，共六十七页，编辑于2023年，星期四3.目标蛋白高效表达策略氨甲喋呤（Mtx）是动物细胞关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的抑制剂，细胞经过氨甲蝶呤处理后存活下来的细胞中dhfr基因得以扩增，提高二氢叶酸还原酶的表达水平，抵消氨甲蝶呤的抑制作用，与该基因相邻的染色体片段同样扩增。第二十页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第二十一页，共六十七页，编辑于2023年，星期四例子：tPA第一个哺乳动物细胞表达生产的医用蛋白是溶血栓药物组织型纤维酶原激活剂（Tissueplasminogenactivator，tPA）。将人的tPAcDNA克隆在含有强启动子和终止子的表达载体上，转染dhfr-细胞，用氨甲蝶呤处理培养，tPA随着dhfr基因大量扩增，新筛选出的转化株进行大规模培养高水平生产人的重组tPA。第二十二页，共六十七页，编辑于2023年，星期四4.动物细胞反应器生产药用蛋白应用举例中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达制备促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）第二十三页，共六十七页，编辑于2023年，星期四红细胞血液是存在于心血管系统内的流动组织，它包括细胞（血细胞）和液体（血浆）两部分。血细胞分为：红细胞、白细胞和血小板。红细胞又称红血球，是血细胞中数量最多的一种。红细胞中含有一种重要的蛋白质为血红蛋白，红细胞的主要功能是由血红蛋白完成的。（1）血液的运输功能主要是靠红细胞来完成的：运输O2和CO2。（2）缓冲酸碱度(血浆pH值:7.35～7.45)。（3）血液中红细胞数量，血红蛋白浓度低于正常时发生贫血，影响了血液运输功能，出现一系列的病理变化。第二十四页，共六十七页，编辑于2023年，星期四红细胞生成素EPO（1）定义与特点红细胞生成素（erythropoietin,EPO）人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，为分子量6～7万的糖蛋白。药用价值：能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比）。第二十五页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第二十六页，共六十七页，编辑于2023年，星期四促红细胞生长素（ＥＰＯ）属于基因兴奋剂，可以增加人体内的红细胞数量，从而使肌肉获得更好的氧供，增强运动员的耐力。但是长期使用可使人体血液粘稠，增加心脏负担，导致血液凝固、血栓等心血管疾病，甚至死亡。在2005年2月份的《神经科学》杂志上，西班牙医生公布了一个病例，一位职业自行车运动员在经常使用含有EPO的药物之后发生脑血管栓塞。第二十七页，共六十七页，编辑于2023年，星期四文献讨论1第二十八页，共六十七页，编辑于2023年，星期四生产EPO的CHO工程细胞电激法脂质体法宿主细胞：CHO：中国仓鼠卵巢分离的细胞CHO-dhfr-细胞（二氢叶酸还原酶缺陷型）：缺失DHFR的CHO细胞不能合成四氢叶酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液上生长。增加氨甲蝶呤的浓度，可提高与dhfr基因相连的外源基因的表达水平。第二十九页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第三十页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第三十一页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第三十二页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第三十三页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第三十四页，共六十七页，编辑于2023年，星期四三转基因动物生物反应器1.转基因动物（transgenicanimal）：是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之一第三十五页，共六十七页，编辑于2023年，星期四转基因牛第三十六页，共六十七页，编辑于2023年，星期四转基因绵羊、山羊和猪第三十七页，共六十七页，编辑于2023年，星期四转基因鱼第三十八页，共六十七页，编辑于2023年，星期四2.转基因动物培育方法（1）显微注射法：大片段、应用广目的DNA制备DNA的注入原核胚胚胎体外培养胚胎移植（移植前鉴定）发育出生、鉴定第三十九页，共六十七页，编辑于2023年，星期四1980年，Gordon等人首先育成转生长素基因小鼠。世界第一个转基因动物。生长速度快2－4倍、体形大一倍的转基因”硕鼠”。发表在1982年的nature杂志上。第四十页，共六十七页，编辑于2023年，星期四第四十一页，共六十七页，编辑于2023年，星期四（2）胚胎干细胞方法胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性的细胞，因此只要将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。第四十二页，共六十七页，编辑于2023年，星期四3.乳腺生物反应器（Mammaryglandbioreactor）将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白的技术。第四十三页，共六十七页，编辑于2023年，星期四1987年Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠.2006年6月2日，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）上市获得批准。目前，α1-抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝血因子Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、纤维蛋白原、降钙素、SOD、红细胞生成素、IGF-1等成功表达，多种药用蛋白已经进入临床试验阶段。第四十四页，共六十七页，编辑于2023年，星期四上海交通大学医学遗传研究所：（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。（2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管牛——“滔滔”降生。第四十五页，共六十七页，编辑于2023年，星期四（1）乳腺生物反应器优点1）生物学活性和功能与天然蛋白完全相同（经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性）。2）对动物的生理影响较小（乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环。3）表达产量高、表达产物的提纯相对容易、生产成本相对较低。4)表达产品的安全性好。第四十六页，共六十七页，编辑于2023年，星期四（2）关键环节使用合适的乳汁蛋白基因调控元件，构建合理有效的乳腺组织特异性表达载体。目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基因及调控序列的主要有：乳清酸蛋白(WAP）基因及其调控序列。酪蛋白(Icasein)基因及其调控序列。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)基因及其调控序列。乳白蛋白(α-lactalbumin)基因及其调控序列。第四十七页，共六十七页，编辑于2023年，星期四（3）鉴定目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因的存在，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交(Dotbloting),Southern印迹分析等多种方法进行检测。目的蛋白的鉴定：建立动物乳腺生物反应器的最终目的是得到有活性的外源蛋白，因此，对目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有：(1)SDS－聚丙烯酰胺凝胶(SDS)(2)酶联免疫吸附实验(ELISA)(3)Western印迹分析第四十八页，共六十七页，编辑于2023年，星期四问题（1）理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因在受体动物基因组随机整合，遗传不稳定、表达率不高。（2）异位表达和表达产物的泄漏问题，需要乳腺组织特异性高效表达载体，保证外源基因在乳腺中专一表达。（3）在家畜转基因技术方面，目前多用原核胚胎显微注射，平均成功率比较低，需要大量的供体和受体动物。第四十九页，共六十七页，编辑于2023年，星期四4动物血液生物反应器外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。血液生物反应器比较适合生产人血红蛋白、抗体和生产非生物学活性状态的融合蛋白,而有活性的蛋白或多肽(如激素、细胞分裂素、组织血纤维溶酶因子等)由于进入了动物血液循环系统而影响动物的健康。到目前为止,已有多种通过转基因动物生产的具有生物学功能的人血红蛋白问世。

第五十页，共六十七页，编辑于2023年，星期四目前动物血液生物反应器主要用于生产血红蛋白、抗体、α1-抗胰蛋白酶(AAT)和血清蛋白等重组蛋白等,目前已成功地在转基因家畜血液中得到人免疫球蛋白、α球蛋白、β球蛋白、胰蛋白酶、干扰素和生长激素等,并且都具有正常的生物活性。Behringe等(1989)报道,在转基因小鼠中表达了α2和β2球蛋白。Swanson等用人LCR区与二个拷贝的人α`、一个拷贝的人β`基因连接进行重组构建,获得了3头表达人血红蛋白的转基因猪,并成功分离到人血红蛋白,而且证实了重组血红蛋白与人血红蛋白的氧结合特性是一致的,该转基因猪表现正常,并未出现贫血症。第五十一页，共六十七页，编辑于2023年，星期四5动物膀胱生物反应器外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5′端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。第五十二页，共六十七页，编辑于2023年，星期四尿液早已是生物制药业中生产促性腺激素的天然材料。最近研究结果表明，将人类的生长激素基因置于小鼠uroplakin(尿路上皮分化有关的特异糖蛋白

)Ⅱ基因启动子的下游，在尿液中获得特异性表达，其表达量可达100-500ng/ml，Zbikowska等利用尿调蛋白启动子指导人重组促红细胞生成素在转基因鼠尿中表达,表达量达到6mg/L。KerrDE等猜想如果外源蛋白在尿液中的修饰加工比在哺乳动物细胞中更为完备，或者外源蛋白的副作用对动物本身影响不大,那么尿液将是生产重组蛋白的重要材料。与乳腺生物反应器相比,尿液是一个比较容易收集的体液,周期较短(转基因动物出生后不久就可以从雌雄动物尿中收获表达产物，而且外源基因表达的产物不进入血液循环，通过收集尿液来获得。第五十三页，共六十七页，编辑于2023年，星期四6其他转基因动物生物反应器鸡蛋蚕茧精液第五十四页，共六十七页，编辑于2023年，星期四四植物生物反应器1.转基因植物（transgenicplant）：指将外源基因转入到植物的细胞或组织获得了新的遗传性状的植物。2.植物生物反应器：是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。第五十五页，共六十七页，编辑于2023年，星期四3.应用研究进展最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。1992年，美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。此后，国内外相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验，为利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础。第五十六页，共六十七页，编辑于2023年，星期四已有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功表达第五十七页，共六十七页，编辑于2023年，星期四哺乳动物细胞表达系统限制因素：（1）即使在最适的培养条件下，重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平仍很低，通常为每天每升数十毫克；（2）重组蛋白最后必需从培养液中分离提纯出来，产量损失；胎牛血清；日常维护费用非常高，生产成本高；（3）哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、pH值、含氧量非常敏感，因此需要对培养条件进行精确的监控；扩大生产规模困难。（4）利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物的污染。第五十八页，共六十七页，编辑于2023年，星期四生物活性好：能进行有效的翻译后加工，是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。构建容易：植物细胞易再生植株，生长周期短，易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间，而且技术更成熟，成功率更高。成本低：外源基因可以通过种子遗传给下一代，