高产纤维素酶菌株的诱变育种

湖南农业大学课程论文学院：生物科学技术学院 班级：姓名： 学号：课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种课程名称：工业微生物育种学评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期：年月日纤维素酶高产菌株的诱变育种( )【才商要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行了归纳和总结.【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种MutationBreedingofCellulaseHigh-yieldStrainTAOMi-lin(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,HunanAgricultureUniversity,Hunan410128)(Abstract!Cellulaseisakindofcomplexenzyme.Duetotheabilityofhydrolyzingcelluloseorthesimilarityofcelluloseintoglucose.Agreatefforthasbeenmadeuntilnowontheresearchsuchasidentification,mutationbreedingandfilterofcellulose-producingstrain.Thispaperfocusedabriefinductionandsummaryonadvancingabouttheseaspects.【Keywords】cellulose-producingstrain;cellulase;filter;mutationbreeding随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物(稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%〜60%固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。1、纤维素酶纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。1.1纤维素酶的结构不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-/-D-glucanases，EC，简称EG)、葡聚糖外切酶（exo-1,4-p-D-glucanases，又称纤维二糖水解酶，cellobiohydrolases,EC1,简称CBH）和。-葡萄糖苷酶（0-1,4-glucosidases，简称BG）3种水解酶组成的一个复杂酶系，其简要作用模式见附表。附表纤维素酶的简要作用模式种类 作用模式葡•聚糖内切酶-GlG-G-G-G-G-,随机攻击什4健・葡聚摘外切酶G-G^GG-G-G-G-G^G-G-G-T从非还原端释放纤维二糖和葡萄糖C—G—G—G—C -*G—G—0—G■"伊葡萄糖脊酶G-G;G-G-C^C；C-G-C-G^G,水解纤雄二糖和短链纤维寡糖两端去掉一个葡萄糖单位1.2纤仑纤维素酶中单酶系的作用机理与溶菌酶类似，遵循双置换机理，其复合体水解纤维素的精确机制目前也还不清楚，但有一点已有报道，复杂多酶复合体的四级结构是其发挥作用的关键，并且取决于葡聚糖内切酶的协同作用和复合酶与底物表面的聚集作用。纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶（C1酶）首先进攻纤维素的非结品区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由Cx酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由。-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和。-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。1.3纤维素酶的用途1.3.1食品发酵工业食品发酵工业是纤维素酶应用最广泛的一个部门。利用纤维素酶处理原料，可改变细胞壁的通透性，提高细胞内含物（如蛋白质、淀粉、油脂、糖等）的提取率，改善食品质量，简化生产工艺；用纤维素酶处理大豆，可促使脱皮，增加从大豆提取蛋白质的得率，亦可回收豆渣中的蛋白质和油脂；用于淀粉制造，可缩短时间，增加得率；用于柑桔果汁加工，可促进汁液的提取和澄清；用于酱油酿造，可改善酱油质量，缩短生产周期，提高产量；用于造酒工业，可提高出酒率。1.3.2生产萄萄糖和单细胞蛋白（SCP）农副产品和城市废料中的纤维素，通过纤维素酶转化为葡萄糖和单细胞蛋白，对人类有着十分重要的意义。美国NatiR研究所的Mandels等人利用雷斯木霉的培养滤液作用于纸浆，球磨新闻纸，日本的外山信男等人使用商品酶制剂作用于经前处理（去除木质素）的稻草粉和新闻纸粉末，所得10%和9%的糖液可作为发酵工业的原料来生产酒精、SCP等发酵产品。利用纤维素酶发酵生产单细胞蛋白主要有两种方法：一种是先将纤维素经酶糖化后再培养酵母等微生物生产SCP；另一种是直接利用某些纤维素分解菌混合发酵生产SCP，如利用纤维单细胞菌等，可直接由纸厂纤维废料发酵生产单细胞蛋白。1.3.3饲料工业纤维素酶和纤维素酶产生菌能转化粗饲料如麦桔、麦糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分纤维素转化为糖、菌体蛋白、脂肪等，降低饲料中粗纤维含量，提高粗饲料营养价值、扩大饲料来源。近年来，国内正努力开发饲料用复合酶，它主要以纤维素酶为主另加蛋白酶、果胶酶、半纤维素酶、淀粉酶、溶菌酶等，当添加入饲料中，能大幅度提高饲料的可消化性及营养。1.3.4其它用途纤维素酶在医药方面也具有用途，它与淀粉酶、蛋白酶一样可作为消化剂使用，目前，日本已有含纤维素酶的消化剂出售。在环境保护方面，利用纤维素酶可消除下水道中污物，把纤维素酶添加入清洗剂中，可增加清洗剂的效果。在遗传工程方面，可利用纤维素酶来溶解植物细胞壁，进行植物细胞融合及水稻杂交育种。2、纤维素酶的诱变育种2.1纤维素酶的产生菌表i，i分解纤维素产生纤维素醇的主要微生物MainTnicroo^ganismproducingceHulose分类 研究的主要菌种T.viride（里氏木毒）♦T.koningii（康氏木霉）*T.psettdokoningiiTT.harzitmvm>Zlignorun,T.longibrachiatum,P.citrinurn常梗青霉），Rjuniculosum（绳状青霉）+PrirensiSfP.janthinellum（微紫青霉〉，P.notation保^异青霉）,P.verruculosum（疣ffe青霉），A.niger（黑曲霉）,A.flavus（黄曲霉），A.foetidus/A.Jumigatus（烟色曲霉），A,<?rysae（米曲霉）fA.#真菌（Fu顽） A.terreus（土曲博），A.acideolusrNeurosporacrassa（粗壮脉纹晦）,HutnicolainsoleartsrAfyrolheciumverrucaria（疣掩漆抱霉）•MaerophaminaphaseolinarFusariummonil^drme〔串珠辑霉）

Myceliopfitaracellulophilum（蚀丝霉属），SchizophyUumcommunefPhomahibemlca（茎点菌属），SclerotlnumrolfsiifHypocopramerdaria（座内粪壳菌属）•JihizopiajavanictarPyrtculanaoryxaerFomesfomentansrHumilcotagrisea♦PleurotusostreatusrPkysarumpolycehalum细菌（.BocteriayC.acetobuiyli（纤维杆菌属）,C.lochheadit,C.hngisporumjC.therntocellulmrCthermamonospora,C.thermocellulasevm/C.stercoraiifftifPseudomonasfluorescerRumirjococcusalbusrR-flavefacienA,CellvibriofulvusrC.gilvustC.vulgarisThermomonosporaJit&ca（热单泡菌属）,Therntomonosporacurvata（热单弛菌属）tKiicrobisporabisporar放线菌口ctinomycetes）Streptomycesviridosporus（链霉菌屈》,Actinomycesmelanocycles（黑红旋丝放线商）,Actinomycesroseus（玫瑰色放线菌），Actinomycescellulaspe（纤燃放线豳）其他Schizophyllwncommune,Sclerotinumroi^iitPyriculaHaoryzae,Physat-uinpotycephalum纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。目前研究较多的是霉菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里斯木霉、绿色木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。细菌中酶活力较强的菌种有纤维粘菌属、生抱纤维粘菌属和纤维杆菌属，放线菌中有黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌和白玫瑰放线菌等。2.2纤维素酶产生菌的诱变方法2.2.1紫外线(UV)诱变用无菌水洗下经活化的斜面孢子，于玻珠小三角瓶中振荡20min后用3层镜头纸过滤，适当稀释，制成每毫升含105一107个孢子的菌悬液.打开紫外线灯(30W)预热20min,取8份5mL的菌悬液置于离紫外线灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上照射1min,然后打开培养皿盖分别照射1、3、5、7、9、11、13、15min.诱变菌液在黑暗中冷藏保存1—2h,再接种于PDA平板上进行初筛。2.2.2硫酸二乙酯(DES)诱变在2.2.1配好的菌悬液中加入DES稀液(DES原液lmL+95%乙醇4mL)0.25mL,振荡40min,适当稀释后涂PDA平板，挑选单菌落用于初筛。2.2.3复合交替诱变分别选取紫外线最佳照射时问与硫酸二乙酯最佳处理时间进行复合诱变。具体方法：先按照2.2.2用DES对ZM-4的孢子悬液进行诱变后，再按2.2.1所示用紫外灯对其诱变，如此交替进行。重复5次交替诱变后，将处理液进行梯度稀释并涂布于纤维素刚果平板培养基中，于30^培养4d。2.2.4微波诱变用生理盐水稀释至10的6-7次方个每毫升的抱子悬液，采用低温分散法于2450MHz微波炉，700W功率下辐射30s—3min后采用10倍稀释法稀释，分别涂平板，30°C培养。2.2.5亚硝基胍诱变选取经UV诱变后酶活最高的突变株为出发菌株，按2.2.1方法制备孢子悬浮液。取孢子液10ml，加入10mlNTG(4mg/ml)，28C恒温振荡处理5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60min后，适当稀释，涂布于筛选培养基平板中，28C培养4〜5d后，计算菌落数量和NTG致死率。2.3纤维素酶产生菌的筛选2.3.1简要流程为纤维素分解菌筛选的简要流程。菌源平板筛CMC-Na刚果红、/复筛/\滤纸失重率固态酶曲培养图1 纤维素分解菌的筛选2.3.2具体流程富集培养：取土壤样品5.0g，加入到45mL无菌水中，振荡均匀，静置取2mL上清液注入盛有20mL富集培养基的50mL三角瓶中，恒温振荡器30°C、150r/min振荡培养48h。初筛：取1mL富集培养菌液涂布于铺有初筛培养基的平板上，28C、倒置培养72h，观察水解圈产生情况，并挑取有水解圈的菌落转接至斜面培养基培养，保存。复筛：初筛得到的菌株活化后，各挑取一环分别接种到80mL(250mL三角瓶)复筛培养基中，在恒温振荡器中30C、150r/min振荡培养48h，将发酵液以5000r/min离心20min，得粗酶液，采用DNS法分别测其半纤维素酶的活性，从而筛选出产酶活力最高的菌株。2.4纤维素酶活的测定方法2.4.1CMC酶活力(CMCase)的测定方法取0.5mL适当稀释的酶液，加入1.5mL0.625%CMC溶液，于50°C保温5min,加人2mLl0%的氢氧化钠溶液终止反应，再加入3mLDNS试剂，于沸水中煮15min,迅速冷却后于550nm处比色。以每分钟酶液产生lumol还原糖所需的酶量为1U。2.4.2滤纸酶活力(FPU)的测定方法取1mL适当稀释的酶液，加入1cmX6cm滤纸条，再加入1mL柠檬酸缓冲溶液于55C保温60min，再加上3mLDNS试剂，于沸水中煮15min，迅速冷却后于550nm处比色，以每分钟酶液产生1umol还原糖所需的酶量为lU。2.4.3微结晶纤维素酶活取稀释酶液1mL,加入1ml1%的微结品纤维素Avicel(悬浮于pH5.0醋酸一醋酸钠缓冲液)溶液,50°。下反应1h,取上清液0.5mL,用DNS法测糖，以每分钟产生1Mmol的葡萄糖为1个国际单位。2.4.4B-葡萄糖芬酶活取稀释酶液，取稀释酶液0.5mL,加入0.5mL1%水杨素(溶于醋酸一醋酸钠缓冲液溶液)，50°。下反应30min,加入3mLDNS试剂测糖，以每分钟产生1Mmol的葡萄糖为1个国际单位。2.5其它选育高产菌株的方法2.5.1优化培养条件任何菌株都有适合其生长及产生代谢产物的最优条件，纤维素酶也不例外。只有在最适生长条件下才可能最大限度的发挥其产酶优势，达到最大利用价值。纤维素酶是诱导酶，需要一定的生长因子以及诱导剂存在才可能大量产酶，而且产物的抑制作用也尤为明显，一般情况下，其最终产物葡萄糖的累积会抑制纤维素酶的活性冽J。所以优化培养条件对于高效产生纤维素酶是极为重要的。现今很多学者主要从液体发酵和固体发酵纤维素酶产生菌株来生产纤维素酶，所以在发酵过程中就要严格控制培养条件。对于液体发酵来讲，主要从基础培养基的营养成分配比，碳源、氮源、pH值、培养时间、培养温度、接种量等因素来控制。而对于固体发酵来讲，除了要控制好上述条件，还要注意料水比，即固液比，还有通气量等因素的影响。一般研究者在分离筛选到纤维素酶产生菌株之后，都会对其生长及产酶条件进行优化，综合考虑各个因素的共同作用使的菌株在最适条件下充分发挥其性能。2.5.2分子生物学手段构建高产纤维素酶菌株产纤维素酶的菌株必然含有表达纤维素酶蛋白的基因，但是由于纤维素酶不是单一的一种酶，而是由协同降解纤维素的一组酶构成，这就要求产纤维素酶的菌株必须含有所有纤维素酶的基因，才可能具有高效降解天然纤维素的优良性能。而实际从自然界中筛选到的纤维素降解菌株中，含有全部纤维素酶基因、分泌的酶系组分齐全且配比合理、可高效降解纤维素的菌株却很少。随着生物技术的进步，分子生物学、细胞生物学等学科的快速发展应用，人们逐渐意识到且有能力利用基因工程的手段来解决上述问题。如果将纤维素酶基因通过基因分离、重组、载入新的宿主细胞，那就可以构建含有纤维素酶基因全组份的高效产纤维素酶的工程菌，那么对于纤维素的降解就会大大提高，从而实现纤维素酶的工业化生产。现在已经有很多研究者将纤维素酶基因重组全大肠杆菌或者毕赤酵母中得到了高效表达。近来丁新丽等就将木霉的内切葡聚糖酶基因和外切葡聚糖酶基因成功地转入酿酒酵母H158中，构建了可以同时分泌两种酶的工程菌。3、展望我国是一个饲料资源十分紧张的国家，土地少、人口多，人畜争粮的矛盾十分突出。要保持我国饲料工业和畜牧业的持续发展，必须解决好饲料问题，否则将严重制约其发展。纤维素是自然界中十分丰富的资源，是800-1200个葡萄糖分子聚合而成。因此，可通过微生物发酵充分利用农副产品下脚料、秸秆、糠生产纤维素酶添加剂，用于提高畜禽生产性能，提高饲料利用率，改善饲料的营养价值，降低饲料成本和提高经济效益，具有广阔的开发前景，今后应进一步加强纤维素酶研究和开发工作。主要有如下几方面：进一步加强纤维素酶的作用机制研究。纤维素酶应用于饲料，作用于动物消化道，其机制尚未清楚。从理论上决定其添加量还很困难，目前只能从实验结果来决定，受影响因素很多，往往效果不够理想。对于单用多种原料的纤维素酶最佳添加量也研究不多，这将严重制约纤维素酶的推广应用。酶的产量和活性都不高，成本偏高。今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，以提高其产量和活性，特别是要注意利用DNA基因重组技术的应用，来选育出活性高、产酶量大的菌种。加强纤维素酶检测方法研究。虽然纤维素酶的检测方法很多，但真正能适合饲料的检测方法还没有，这给实际应用工作带来困难，如无法比较不同厂家的产品质量，确定纤维素酶添加量也很困难，应组织有关力量，制订出统一的检测方法标准，供生产中应用。参考文献(References)魏艳红.纤维素酶产生菌的分离鉴定及产酶条件优化[D].华中师范大学,2009:1-43.⑵齐海萍，胡文忠，范圣第，朴海月，郑冬明，隋媛.纤维素酶产生菌的筛选[J].江苏农业科学,2010(3):420-422.程时军，付大波，张伟.纤维素酶协同作用研究概况[J].饲料博览,2010(8):10-11.刘颖,林亲录.纤维素酶制取与应用研究进展[J].中国食物与营养，2006(4):33-35.魏亚琴.纤维素酶高产菌的筛选[D].新疆:兰州大学,2007:1-52.刘春芬，贺稚非.纤维素酶高产菌株的诱变选育[J].中国酿造,2008,182(5):29-32.E.McLellanandP