体外试验与生物新技术在毒理学中的应用

第一章体外试验与生物新技术在毒理学中的应用体外试验毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。过去利用整体实验动物模型或称体内试验(invivotest)模型所提供的资料，判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(invitrotest)在上述过程中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的重要方向是体外试验。②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。一、概述(一)分类毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。在有些情况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：①筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。(二)基本原理体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或DNA分子等等。(三)体外试验的优缺点体外毒性试验的优点可归纳在表12—1。表12-1体外毒性试验系统的优点能控制环境因素可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等施试验些间的港误差植较少腥可同草时和矩／或范反复鞠多次勉取样喉可做劣成复桨杂的窄互相尺作用怖的试蓄验系粉统，注如复简合细棍胞培宏养等沿较为也快速巾和经盼济巡需要各较小娃量的早受试流化合淡物别产生子较小巨量的讽有毒富废物炭可以经利用夺人体添细胞还减少砖整体捷动物畜的使鼠用复利年其中豆特别晕值得藏一提甜的优伸点是她体外挺试验叹的简欣便和戚易于父利用鸦人体望细胞咽。体狠外毒必性试叨验结芦果可奖迅速香得出特，将小减少牌了解血新化烟学物设毒理彼学资咳料所全需的猾时间泼，最移终可卖以缩屯短从鼠新化细学物盛的合餐成到披产品颜进人肆市场完的时索间过公程。竿此外或，对查鉴定娃毒理领学资遗料有载问题艇的新运化学党物，关可及执时终止止开掠发，据减少索由资会源到评产品迫的投膝入。液在毒宣理学锅整体异试验中中禁否止直叠接进浪行人匀体试领验。仔但毒暑理学权试验骗的目缘的是枪关心辜人类诱健康葡，目语前主雄要是伍将动秃物试岁验结芬果外颗推至谈人类铁，物胳种间征差异菠为其凳不确叼定因符素之煤一。欧在体桑外试否验中市，利很用人奔体细呼胞组辨织进残行试情验，泼可较介好地常解决证物种拢差异熟的问蒸题。礼咳碧体外著毒性可试验烫系统澡的利蓝用在筛目前冤尚有柳不足吼之处念：戴①悟体外思到体进内外钓推的察问题荐。体失外试惹验是脚依据叹毒性票作用架的始纠发阶懂段及阳继续彼发生株的分渔子与番细胞月反应夜，其剧与整抱体系哲统有娇差异坏，如信何将盆产生羡体外愈毒性训的体警外浓选度与请相应敞体内忽剂量龙联系通的问硬题是框最终安未解追决的乔难题李。它皂需要途更好零的工哈具图——旅预测绑性毒素物代旷谢动跪力学烤来解草决，龄其关冶键在化于发猪展有互生理床学基冷础的锦毒物拖代谢篇动力问学模霞型。茶另一绞方面专，体劣外毒纹性试功验中锻缺乏仅毒理巩学反尽应的摊调控桌因素察，如洞细胞棕与组永织的援修复始过程踢和免娱疫系烟统的旷不同题类型外细胞傍间的务相互烟影响孕等。神假如库有了驾更全扣面的志毒理剩学过己程的刚基础窑知识茂，可颤设计戏更符陡合整译体动梳物模然型的径体外蓄系统善。但捷现阶变段毒馋理学伤作为惧一个央学科泄的发遇展尚皆缺少犁许多葬重要冒的资努料。岔②趴体外刺毒性街试验井难以辰预测相慢性插毒性抄。因交为，精慢性遮毒性齐病理片过程甲的机挖理所银知甚谅少，照缺乏穷发展河体外酸试验破的理催论依处据，巷再者典，某堵些体获外系杆统仍茂难以勒达到皂长期各维持时生理狼状态混的要泻求。械仪二、仍体外颈试验师系统王补旗(一神)脾脏器那灌流凶饥记1.凭肝工脏灌先流惠是累毒理箭学中薯研究毒外源想化合古物对帆肝脏述损伤扮及代眨谢的以常见苹方法医。在锻灌流约液中吼加入咱外源钻化学攻物，饿此外巴要维贴持灌敲流液弦的p腊H值利、氧骡含量赤，还健要控充制适臣宜的鸦灌流答液流严速。蒙一般丈是以泊下腔吃静脉猛和门鸭静脉嫂为插广管灌落流通踏路，垃为此趁应结殿扎肝逝动脉位、上得腔静完脉，很在恒览温条潮件下尸灌流赶。有颜报道爬用肝格灌流殊方法谈研究籍四氯些化碳籍及其参氢取肤代衍冬生物尖三氯俘甲烷背与二嘴氯甲裁烷对奴肝脏培毒性哨，结石果发户现随漠着灌赔流时泡间延编长(称在4走h之醒内)交，灌结流液摸的上摔清液供中K咏+眨、谷斧丙转需氨酶谢(S沙CP带T)叨、山滋梨醇搬脱氢朴酶(壮SD谜H)宅、谷虹氨酸检脱氢览酶(未GD拥H)锦增加肿，说馒明三垮种化骑合物剑对肝毒细胞踢均有某损伤型，而渴以四灿氯化饶碳为饭最，满且依勒氯原趣子被谈氢取吴代肝庄毒减亿低。峡需指树出肝蹈灌流述时间班不能慕过久沃，以起4h请之内波为宜义，否属则肝制细胞宇的功肚能与匀生存话不能勾维持仿。雀河饰2.铲肠普灌流苦恒利用交某一茅部分芽小肠弯体外倘灌流智可以虾研究土一些锄化合疾物的称吸收海及动宇力学厌过程源。如升用大远鼠，足则在印麻醉沫下切资腹分资离一万段小灾肠，腰在保众持原康有血捷液循亮环体忆系下挖，将怠肠两私端插敢管，磨清洗牌净肠曲中内敏容物较，在剥恒温晴环境搅中灌仰入灌筒流液煮。例着如有培人研竭究锌贪的吸蜘收及挥其影件响因股素，根以大启鼠回伏肠段岂为标例本，杏证实扯锌吸蚂收呈犹二室散模型懂(肠荡腔为肢Ⅰ饱室、歇肠粘扒膜为间Ⅱ僵室)烫，苯沾丙氨咬酸能鞭增加旗肠腔遗与肠传粘膜袜之间巩锌的乳交换走，且瞒加速证向血扎流的滥清除凳过程烟。胶肠杨丘3.雹膈灶肌-羡膈神夸经标黑本屑取豪完整阵的大留鼠膈傅肌-活膈神彻经置平于恒半温灌歪流液展中，正，在侨几小费时之稳内可红饺吵锐熊恩匪隔歌写胞转哲周有帝短蚁缎奖妇脚慰英(二定)动脏器巾切片良鹅每肝脏声、肾王脏、轧脑部武及心科均可选以制匙备切尿片。诞例如引，脑圈片和结心肌迟条等六是将禽组织塔片置画于恒链温的盖孵育汽液中兄进行背有关宇试验私研究夫，但麻需注马意切米片中疑的细颜胞需慈保持疑完好锦的细耍胞基它质和掠细胞桂之间乳的交吨流。衣切片稳厚度归一般魄在2灭50房μ梅m。拳不同青研究栋期间锹有别握，如割肝切块片研萄究C盘yt若P-晚45悟0不票应超粒过8屑h，脂脑切往片一顷般在在6h权左右我。此趟系统牧的优应点是菌保持发了细羞胞之僻间的雕结构锋，其跌操作意也比慕脏器售灌流哑容易萄。不筛足之纳处是武切片匹内的以细胞死易于泽缺氧哑，且膛受试卵物也促不易腾均匀当到达谨细胞舅内。件陶境(三补)狂原代攀细胞锅培养嫩珍1.州肝趴细胞房原代拉培养哥祥肝细袍胞尚珍未建散成传评代的纺细胞仅株系狮，多挨用原攀代培仰养。全肝细攻胞原袋代培膨养期膛间细陷胞不趁分裂暂、不罗增殖伸，但半发现平基因钞转录斥是存朵在的休(培何养初龟期2六4h乌在1末％或妖以上镇)。朵细胞孩原代毁培养肥维持蛋生存费期1裁～2洞周，槐但是挤Cy胃tP蛮-4县50杀却在妄24距～2还8h逆活性骂减少胶50诱％左慨右。孝据报拥道人血肝细文胞中想Cy傲tP仅-4挠50挎活性疲稳定攀性比树大鼠简强。伪倦督利用圾原代肉培养文的肝避细胞惑可以品进行呀多种背毒理逝学研扫究。游如研啊究化似学物佣的肝准脏毒秒性，悔一般李认为尸，用蕉原代客肝细软胞培搏养筛葛检与睡鉴定鹊是否魂化学就物具坑有肝青脏毒派性较钉为可捆靠，证与体框内试阁验相涌符合贯。有够报道野以肝党细胞渔损伤度后某狐些酶劫释放袭为指肢征，供研究晃30垃个化躺学物演，结衬果除迅少数自化学啦物在通肝细唯胞培视养中饼表现污毒性谦比体扯内试瓜验低将之外双，多阿数化孩学物皱内外辰毒性集符合臭一致旬。在终体外早试验跃表现计毒性炸较低钥的化宋学物侄有环手已酰屑胺(奏cy泊cl丹oh表ex路im强io贡le绪)、星溴苯尺(b滚ro轨mo添be荣nz捐en需e)犁和长臂春新颈碱(泻vi角nc颈ri侍st糟in痕e)丙等。勺蜻诸慌妄2.原巨恳噬细气胞主豚滑鼠或穴大鼠能都可裹以肺隶灌洗帮方法溉获取域肺巨辜噬细恶胞，缴小鼠贴可用范腹腔释灌洗巨获得农腹腔矩巨噬莲细胞专，甚斯至人搭也可扇通过寒肺灌拐洗得逆到。翠巨噬滋细胞盘可以滴用于标多种屿体外论试验叔，例静如利蹲用巨渔噬细涉胞的兽免疫幅功能近检测傻外源麦化学宏物的殖免疫桌毒性余，又沾如利根用巨股噬细散胞检症测以断肺脏槐为毒周理学久终点羡的外瑞源化择学物陶的中报毒毒辆性和悉机理躲。关左于后佳者，晋有人寄利用盖豚鼠泻肺巨衫噬细懂胞原朽代培拍养纯舅化后血，研联究二重氧化萝硅(烦si戏li合ca津，S挪iO就2逆)致疤矽肺搂的机汁理。烦炉务软宁3.谱淋束巴细躲胞依多联用小最动脉抄脾脏逢分离尘淋巴熊细胞叔或进董一步荷分离逃T、扎B淋厘巴细名胞进美行免宰疫毒鱼理研攻究。堵例如奸研究那镉的斜免疫连毒性舌，证狼明镉啄可以深抑制零淋巴左细胞图转化具和抑纱制白螺细胞虏介素盗-2读的产尊生，廊且在畜一定致条件姿下使闸淋巴简细胞每内游娘离钙盏浓度形增加概及钙挽调素杂(C移aM栏)活吧性降志低，盯此为奴镉的政免疫航毒性鞋机理冻研究率提供砌了线惕索。迹陕贸4.棒脑欣细胞骑茂分离划的新角鲜脑霸细胞答有助准于研爹究外龄源化纤学物劫对神健经系吐统损笋伤的绝评价霜与探付讨其箭机理心如用堡小鼠绞大脑仆皮质民分离旋、温躺育后妖，研顷究二厚价阳忠离子房钙、灭镁、罢锌、稳镉等偏对皮哥层神握经细喉胞的篇损伤愈，发络现这迈些离杀子随厕着浓姐度的模增加拍，脑驰神经份细胞女的电姿泳迁端移率信逐渐纠减慢啄。园喂乞随着鲁脑细盐胞技洲术的冠发展内，还米可在应温育朝体系紧中存萝在外妨源化浊学物装情况凑下，祖用微督电极征插入阿脑细热胞，薯通过坏电信傅号的暖变化管，更很深入拆地研罢究外忌源化抹学物庆对神明经细滤胞的筒功能姨损伤伤。昼够午5.测心照肌细陈胞凭心咐肌细队胞用址于毒偿理学蹲研究捎的报黑道目封前还临较少俯。用蔑新生苗1～句2日掩龄大到鼠心不室肌蚊分离袄心肌非细胞点，原监代培浙养4疯天后这，将庙微电党极(糕直径泻<0怠.5受um缸)插宴入细饭胞内宏，研杨究镉护对心怨肌的患影响邀。经避记录取、分升析各英心肌众细胞买动作鞭电位忌参数兔，结稻果镉汽在5该～2无0浑μ恭mo袍l／殊L浓冶度下脸，可始使心薄肌细娇胞动而作电虹位及喂最大雄除极刑速率抵显著放降低左，表驳明镉玩对心夫肌有栽直接鼠的毒月性效皂应。类召觉此外功，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整体羊细胞壮的一丸般毒盯作用扯和正去在分色裂组葱织的纤毒作抖用；键二是占利用筝已高剩度分饥化的蚁细胞足，无恐论是驾原代职培养爬或是桂特定割的细骄胞株作，研唯究受帐试物狠对已赏分化易成熟身的细塌胞或闲其功过能的迷特殊块毒作增用；趣颜义二、朱基本化技术习仪器便与设米备析骑1.义培炊养箱维匹一般楼来说狮，在志5％叛CO躬2俗，9蜻5％把空气阿和9蹈9％则的相例对湿鲁度的挖条件于下，去许多团细胞母可存跪活。茂故细积胞培绪养的伟关键秀设备箭是C特O材2攻培养茂箱。坟其基册本要粥求：论①册精确性地温钥度控麦制调招节，朽一般朝在土之0.歌5雪℃配，箱落内温辰度的充均衡友可依展赖风者扇；激②出CO员2瞒浓度亚调节状，利魔用C练O摸2惊传感冷器监熄测箱尘内C丈O挽2敲浓度牺；使上箱内胃大气剧为5昏％C机O严2耳，9灿5％粘空气毛；竹③据箱内答湿度呢，可贸用水年盘来哄维持把。有陶的细葛胞培喉养可汁以不遥控制件CO虑2标分压畅。例辟如，即原代悟肝细率胞培渐养，鸦可用文Le突ib宪ov鲁it暑zL麦-5棉介质不，不敢需C苏O会2优，而区要求纯敞开必培养江瓶，两以供蛛给较淋高的拖O放2案分压垦。贫汁显2.捞冰档箱和煎冷柜拳瓦冰箱珍(4蹈℃凑)用良于存讨放培榜养介永质，械冷柜储(角—熟20钟℃邪)则衣存放凡酶，慎(如推胰蛋阻白酶慢)和终某些阀培养饭介质盐如谷喊氨酸南和血燥清。轨体谈3.桃显贪微镜访举最基奸本的琴配置舱是一馋台简蠢单的射倒置聪显微仪镜，侨用作夸日常斗观察汗培养险中的架细胞打，以偏便依叉据细现胞生谱长状予况，量进行嫌调整参或对孕污染偏进行仅补救厨或处拜理。愉进行桐进一击步的价研究稠，则属需要誉更高累级的熊显微屠镜，煤例如无，相央差显奋微镜秤或荧柴光显歼微镜愿，并岭附有姥照相翁装置册或摄针影装烟置。袄帅锄爹射4.笔超巡净工恢作台稿壮在没崇有无办菌操垒作室第的条婚件下服；可缘用超阀净工伟作台评。它躁是一皇无菌恋操作陈装置言，主蚊要是虑利用狡鼓风威机，流驱动状空气复通过困高效魂滤膜寺净化炊后，禾缓缓房通过宫工作舞台面室，使谈工作潜部位疑构成瞧无菌材环境裂。它管具有砖占地软面积馅小，怠操作碰方便乱等优跃点，袜但它拜尚难韵绝对反除去自病毒宣类微婆生物戒，而膊且灰写尘过戚多对牢净化转作用旅不利抖，故族超净恶工作申台最元好安屋置在眼清洁舟无尘扩的房防间。拖塔棵沟毕5.踢清误洗和顺消毒烧设置凝：培澡养中附所用蜡玻璃械器皿市可用椅电热兴干燥灾箱消炕毒，畜要求袭温度蚕16刃0博℃足以上陵，最轻好使识用较掉大规瞎格的汤干燥其箱，樱如6催50东×冷50供0巾×塘50扁0m叹m。期藏嘱器皿浊的清独洗可惭用超州声波努洗涤形器。轰吸管粉的清艘洗采命用虹齐吸原栗理制傍成的统冲洗贞装置挡。金让属器允械如啊解剖强刀、墨虹膜感剪、秋镊子置、尖尤镊、头止血佳钳等朋可用锈高压信蒸汽揉消毒助。捷怨疲6.逮培明养器疗皿丧为竟了清掩洗的反方便解，塑福料瓶挑皿正呀逐步旱取代帮玻璃沃瓶皿文。特觉制的栽塑料丽瓶皿革具有驾透明驰、平滑滑、垄无毒疑性、贼有利蒸于细寿胞生姐长的吊优点筋。主少要的忙塑料唉瓶皿艰有；谎①乡多孔巾培养曲板，纺其规净格有汪4孔旗、6暴孔、羊24艘孔及感96赚孔，按它体键积小吗，适鲜于少围量细输胞或母单个古细胞狮克隆质的生汽长；罚②氏培养目皿，若规格阔有直蓄径3翁0m坛m、让60鸣mm康及l端00著mm促，与响玻璃押培养祝皿相饮同，奋尤其斜有利折于集白落形墙成和沙细胞隐转化镜等试通验；容③盲培养崭瓶，暂带有拜螺旋瞎盖塞梳，规阅格有暑30做ml港、5技0m尾l、嫁l0妄0m踩l及渴50痕0m凉l，扬适于贼在C叠O邻2阔培养蓄箱中于使用直；壁④臣其它谢：冻景存细仿胞的仁塑料伤安瓿洋及微饰量加示样器迅头，点后者热的规筒格有汉20兔0~逗10侨00夺μ态1和心1妇μ坊l~谋10央0颗μ子l二溉种。防悲妄赛仿玻璃仇器皿嫂在实受验室镰仍不漂能完笛全被术塑料深制品级取代臭，除粘培养岁皿和瓶培养沈瓶外昏，主等要还绳有：宴①减吸管忙，它伙包括棍刻度钻吸管坏和移澡液管侄，常今用规监格有恰l0荣ml木，5趁ml模和l素ml归；辫②浙玻璃余瓶，扫用于姜配制受各种钉培养墙液的配储贮蜜存液罗和血攀清等鸦，可糊用生殃理盐壶水瓶轧或血聪浆瓶塘代替猪，规寺格有愤50日0m但l、幻25旱0m胡l和亏l0发0m技l；律③厚离心辉管，导规格们有5场0m澡l、猎l0舍ml候和5建ml和，用僚于细扩胞洗风涤。夸爷绵7.子液躁氮贮粮存器嗽恭贮存醋细胞碑多用摄液氮盯，液聪氮温们度在受-1护96溪℃备，具灯有经仪济、裤省力夺和能暗较好料保持舌细胞多生物时学特别性的串优点扁。液钥氮贮冒存器蝇有2暗5L浸和5且0L离两种久规格堤，它木与液碰氮运马输瓶筹，或病称杜造瓦瓶费不同足，因三液氮兽贮存婚器一阔般每辫两周奏需补苦充一迷次液悲氮。串如有炊需要不可配堪置贮弊存器裂和运晒输瓶惰。汇像屡8.路水茄纯化酱装置铜倚细胞腾培养块对水教的要军求较于高，眼通常辞要求成使用亦三次妻蒸馏取水配谈制各套种培健养液健。对捷玻璃算器皿珠也应梅用纯衬水清记洗。的但是寒，在联细胞冰培养惭中，绵不宜僻使用府去离丙子纯随水，看因其狭不能间有效俘地去黎除有河机物涝。宜故今实验锋室应索配备壁自动蜻加水麻石英睛玻璃管管加亡热的筹蒸馏稻器，牵具有线蒸馏杆速度恢快，杆使用柔安全宏等优并点。坐外购周蒸馏度水或痒去离滋子，勿应在材本实喉验室眼重蒸选后使峡用。笋对水仪质量藏应经惜常检尺测，叶如p估H和痰电导泥系数件。同富一实萌验尽蜂量使述用同盒一水欲源，载避免冒水质奋量造嫌成结候果的订差异曲。单欢冷厉裂9.斥滤绑过消漠毒装筋置居培摄养介朴质不缘能经端高压是蒸汽稳消毒员，而巧需通纲过孔世径为渣0.艳22是μ猛l的再滤膜疫过滤拣消毒装。滤室过消太毒装柜置由刑抽气赞泵(捆水流局玻璃鸣抽气峰泵或傻真空能泵)构、安剧全瓶效、抽宝滤瓶匠和滤持器组忆成。赌10屠.灵一般航设备涉理离心疾机，特用于区对细哭胞悬锁液离缘心处案理，略以达赚到细煎胞洗夺涤、抛调节余细胞绕浓度兼等。纤瞒遗天平别，包悔括普著通台衫秤、剑扭力纺天平派和分滴析天奥平，带用于引配制猫各种却培养坐液、竞酶消坏化液境及生余理盐絮水等得。图躲洲缠热酸度伸计，绿用于晃准确绍调整交各种未介质踢及生他理盐艘水的婶pH当。谢兵碑电磁行搅拌墙器，飘微量徐加样转器等康。鞋论帝(二快)狂培养摧用液铁胞除指细舅胞培环养中村所使硬用的油溶液时，如笑培养惭液、唐消化龙液、主pH恶调整怕液、彻染液锐及细菠胞洗芒涤液荷等。峡培养螺液的突选择袜取决御于细六胞生蔑长的简要求构，故厦它是躲维持尿细胞中生存事和生堆长所额需的炕基本蝶溶液球，它计的主编要成徒分为费平衡伤盐溶纸液和屋适应足细胞年体外执培养旁的各超种溶蚕液。准丰运锐津培养预液在艺制备牧过程沾中应耀严格情操作血，避邮免混幕入杂夹质。汁应特文别注协意下颤列问奇题：嫌①奔容器冰，应靠仔细童认真已清洗雅，必轿要时跪须消思毒；燥②葡水，逃三次惩重蒸芝蒸馏虾水；印③杂严格划选择害品质黎优良连的药立品；怒④成制备屿好的藏培养貌介质岔要标邪明名绞称、倾配制瓶日期猜及配寻制者医；丽⑤妙贮存辩与消绢毒。析藏喝窝衫1.抓平基衡盐炸溶液么泡常用冈的有烟Ha倚nk起s液谢、E亩ag假le厚液及窝磷酸潮盐缓俊冲液朽(托PB洞S)更等。视它具惧有维马持渗虾透压皮、控载制酸胞碱度厉平衡警的作车用及刺供给捉细胞妥生存或所需覆的能刑量和乞无机诸盐的笑成分直。它弹是配征制各亦种培拍养介懂质的死基础娱溶液你，也只是洗颂涤细碎胞的壳溶液侦。记隆做规暴2.胞小登牛血度清刊是讽细胞高培养呆中最岗常见扔的天朽然培镇养基意，它劈具有宪丰富颗的营骡养物应质，栗对细估胞附的着和受保护剑也有评明显宫的作正用。恰但它云有成畏分较蔑为复更杂、芝个体悟差异尖较大突、来惑源也副有一典定的生限制踪等不雾足。宏弥补旱个体凑差异变的办三法是浊对血若清进聪行无立菌检任测和显支持隶生长佩能力柿测定修后，补混合祝使用跪。天岂然培岁养基须除小洋牛血种清外蛙，还帝有鸡靠血浆姐、鸡局胚浸怎出液专、水汉解乳窑蛋白夕和鼠恋尾胶滋原等锡。全霸票3.邮合捏成培呆养基联怪系依锈据天乖然培造养基慕的成蒜分，劫用化鸟学物柳质模牵拟合悲成的锹。如航最简旷单的否ME评M集Ea饱gl爹e培品养液笛，包搭括1平2种本必需摆氨基参酸、苍谷氨浩酸胺绍和8厘种维挣生素洲。根京据需框要可术添加初某些叉成分古，如受碳水身化合左物(半葡萄利糖、腔核糖艺、脱取氧核店糖及遍丙酮尤酸钠皇等)驾、核刘酸的值前体社物(戚嘌呤化和嘧证啶类觉化合办物)姐及氧嚷化还挣原剂云，抗才坏血欧酸、肥谷胱杠甘肽宰等。淘拉番如进别行无糠血清座培养破，除肿上述缸营养悼成分瞒外，星还应膝加入秩纤维货连结扑素、摩多聚毫赖氨甲酸和溜胶原对等成劈分以魔促进亲细胞燥贴壁介。有痒时，侦还需裳要加婆入酶帝的抑帜制剂滚，如谷大豆拉胰酶慰抑制阳剂。泡降忌为了崇防止顾由于再操作瑞不慎家所致神的污耽染，晓可加喷入抗卡生素退。常楼用抗念生素重有青疗霉素怨、链笼霉素赚及庆旬大霉秒素等武。处下筝4.假消套化液顺热进行鸭传代魂细胞疾培养爷时，跌为了起使细炒胞脱骗离生场长表苦面和郊细胞贷离散雕成单查个细肉胞，琴通常巧使用丸消化少液。猛常用菜的消闹化液取有胰仙蛋白广溶液逼(0营.2陶5％沫或0造.1荷25刑％)匆和乙娃二胺呜四乙短酸二嫁钠(泡Na喂2把-E陵DT爽A)望溶液斗(0匆.0棋2％派)。兵援鉴奔漠5.恩其乳它他p侮H调惭整液蛇，为触了营浑养成足分稳姨定和算延长婶贮存城时间就，配甚制生苦理盐削溶液龄，和煌培养亏液时锅，均那在临重用前蛮加入亿Na彼HC树O裤3硬溶液罢。常狐用浓脱度有苏3.廉7％方、5颈.6吹％和快7.政4%极。此发外，蜓还有虹HE茶PE裤S溶穗液，巩是一肠种氢姻离子罚缓冲吹剂，偏能较眠长时逝间保敞持恒涨定的光pH矿值范殖围。讲使用嫩终浓山度为构10悉～1小5m堤mo梁l／耕L。溉喘削染色荡液：劫常用纷的有愿①储苏木起精-杯伊红召染色警液或闷称H踩.E已染色磨；淋②剩Gi圈em救sa拳染色若液。茧质肌固定啄液：享常用来的有腿①萌中性逮缓冲违福尔捐马林泛，相警当于车10纯％的枯福尔叫马林萄；强②弃Bo点ui奴n氏孔固定骑液；拼③泛醋酸种甲醇古，临愚用前挣配制迫，结厉合G杂ie捧ms刘a染侄色效敬果较窃好；僵④桌FA璃A固朝定液救，由卫福尔商马林逢、冰猴醋酸觉及8厅0％烫酒精叠组成础，用民于盖廊片单狭层培脏养的惨固定蔬。呜昂址(三毛)骆消毒普技术言肤挤在细羞胞培敞养中葱，消晌毒是煮最基凶本的恼一项绢工作光，它际直接纽影响登实验员的结扩果。钩消毒伴措施往应在肌细胞吼培养监的每立个环标节严壁格执些行。屑细胞徒培养虹的微锈生物偶污染疼，包宴括细域菌、辱真菌着及病解毒，针它们庄主要问来源黄于：杀操作侮者的稠粗心接；操吸作表未面或拥周围查的环肠境；惊培养翁液及纸培养桥器皿蝶的灭默菌不汗彻底津或存分放时踩间过棵久等歪。韵摘成对不晓同的阶细胞宝培养苹所用扁物品果，可啦采用困不同器的消拒毒灭流菌的稍方法字。一埋般有可两类肆：一细是物谷理灭化菌法复，即昂利用物紫外剪线、拜干热提及微款孔过聚滤等赌；二庭是化榴学灭溪菌法森，即苏利用向化学铲消毒递剂。温主要辉消毒凳方面缠法介弱绍如蝇下：晒改胳1.同紫恶外线坟超适于客消毒平空气玻、操坟作表绑面及匆一些肠不宜察用其职它方芝法消询毒的赠物品至和培恭养板澡等，鸣使用通方便碰，效庆果较珠好。叠应注旁意其踢可产跳生臭犬氧，感影响景健康帐。过病罚等驼2.妖高爸压蒸巴气消父毒您它毙适于奋金属迈器械务、胶锤塞、持布类锈及某努些培雪养液澡。一宇般要鞋求1越5磅种压力仰下2柿0m倘in驼。或燕者更雾简单钢的，炼煮沸排消毒扑，其捕不足戚是湿辣度大华，不晚易久删存。匀截脾3.趁干遮热消枪毒管适临于玻傅璃器复皿，具消毒育后器捉皿保借持干加燥并堵便于彼使用禾贮存引。加纱温应锻到1资60残℃肯，保可持9捞0-速12盟0m动in始。糠柳少4.麻滤堪过消撒毒贩适卧于大盆多数泛培养道用液多。选旱择孔颠径为栋0.更22厌μ饲m的武微孔普滤膜构，过千滤除到菌效木果较纽佳。鞭莲灿5.熟消柱毒剂降孤适于风操作乐者的启皮肤捡、操闻作表煤面和向台面挎、桌志椅及践墙壁骗等，化常用甲的消跃毒剂间有来敌苏儿辱、新姨洁尔迷灭、陈过氧衰乙酸呜及7撑0％烟酒精租。贷三、尖培养垂细胞衣的鉴欲定女腥混络揭对培圾养细悼胞的扶鉴定猎有两忌个目徒的：奶一是帜观察逐培养桨有无到变化威，以符决定谦是否壁终止岭培养绳，并利从冷洁冻贮欧存的普样品楚重新方建立沟新的谱培养哀细胞鲁；二基是培屋养条苦件(执如培沃养液添)变傍化，骡对培亚养细蠢胞的省影响垦。因馆为培锹养条头件的糊一致杨性，翠对于甲实验练结果谊的可现信性幻有极堡为重牢要的比影响附。对逗于培功养细跟胞的违鉴定她包括瑞污染昆鉴定见、生鸦存指绘标及雷细胞穷性质宪(如吊细胞饺形态灵、生限长特恭性、诱染色绞体数浙目及衫结构膀等)疑。蔽强爹(一贸)钞污染兆鉴定员中吴细胞嘱培养尿中常主见的雁污染椒有真驼菌、巡细菌学和支晴原体走等，制此外跟有化壶学物箩和非盛同一瓶种细丹胞的拌污染悼。受描到污锈染的冷细胞祥培养专可明圆显地逝改变王生长亿特性届，引洗起p丘H变钢化和荣生长梦迟缓拥。污喘染常魔常表昆现为魂pH迎变化叹，培棕养液棍表面办起泡望或起陆膜，旧培养扰液中址的絮好状物挽及细江胞生竟长表钥面的熔斑点弃，摇闪动培务养器早皿可浆消失蛇。肉灾眼见她不到耻的污岛染可穴影响决细胞流的代轨谢。捎革凤1.临鉴府定方仇法宵真贿菌或罚细菌诊的污词染可扎用肉颈眼或怖低倍问光学艺显微紫镜观错察，崭支原唉体仅卷能用堤特别际的荧块光染芝料如柳Ho场ec绝hs阶t梁33咳25估8染缠色后蛛在光玻学显忧微镜番下，酒或用次扫描灭电子庸显微竿镜观碌察。千由于芬用肉信眼无粉法发泰现支拍原体垂的污蜻染，牌在细辈胞培根养过幅程中乞应经盖常定盟期检扣查，换例如纠每三府个月立。最贤简便附和最姜可靠姜的检泄测支膨原体待的方备法是移用荧副光染侵料染军色在约显微惹镜下仍观察外。害奉制2.欧处秒理拉基奥本的炭良好粗消毒研技术熔并不拼一定倚能防蚕止污况染，眯还应郑注意贼下列厌方面型：消烟毒步狮骤(榨如高氏压锅艘和干沫热消佳毒柜归)的跳效果顾；多被层流村防护背罩的风消毒掉效果察；经吴常检惊查培州养器级皿；营每个溜工作魂者有焰自己梨配制扬的培昆养用蒜液，壶处理誓受污团染的埋培养晴用具箱和环诱境。卖对于我已污氧染或册怀疑验污染烂的培怨养用肢具均原可用证2.涝5％埋高氯餐酸处屈理。搬用抗借生素说对预亦防或算去除刻细菌收污染填较为杂有效悄。对双支原史体污溜染，破消除住方法江较多黎，如稠抗生什素、专加温让及动遇物体蓬内接灵种等岭，但协都较瓜为繁冬琐，眯且效下果不例甚满汤意，项最好隐的办企法是多弃去直，再洞重新验培养工。内孩福(二给)种生存顺指标倒誓从1.何台忽盼蓝塌排斥约试验补开是判驶定细台胞损案伤的恒快速非试验莲，它厉还可利很方吼便进事行细蔽胞计扇数。任具体槽方法贴如下促：汪①被取少叶量细葱胞混调悬液缎，加雪人等起量的缩0.肉5％瑞台盼唤蓝溶捷液。尝②击放置穿1-递5m阔in壤后，摘将混帐合液统滴入杏血细刻胞计诱数池狂内。射③霸显微敞镜下检，细伍胞显胡蓝色烫的为元死亡鹿细胞款，尤内其是矮核深雾染，信而未蜂染的鬼细胞纸为存鸟活细看胞。纵统计壁出细宪胞总毛数后城，可来计算阅出细票胞存盛活率役。明过酸2.升酶兼漏出客的检贴测里胞仍浆酶吴如乳鹿酸脱层氢酶盆(L塔DH墨)的复漏出日检测惕也与吼染料百排斥碧试验丽有同沈样的淹灵敏翁度，效同时恨，可专更精岂确地于进行阻定量眨，但叹操作鸡时间震较长搏。仇拴艺(1语)详仪器康：分覆光光列度计庙，最厕好配屡有温非育(蛾37阳℃愉)的么装置闭。逼蛛池(2廉)亚试剂艘：淹仰民溶液隶召0.吐9％乔Na娃Cl怖，0吉.1脖％T置ri伏to腔rX栗-1蹦00壤和0津.1障％牛踪血清双白蛋竟白。数北形底物杯姥3.镰5g徐K著2斑HP辜O激4短，0钩.4牙5g誉kH集2室PO换4会和3说1.炕0m转g丙鸡酮酸挺钠溶需于4匠50立ml却的蒸斧馏水爷。配束好后紫，可平贮存峰于-务20威℃爽的冰健箱内胜。怠锡甲NA敲DH挽，称秘42距mg平，溶销于4虚.5束ml衫的1纷％N意aH奋CO唱3蝇，临互用前饺配制胀。软退沿(3串)疗操作挠步骤获：离萝心，射以适哲当速残度使递所有愤细胞羽沉淀启而不酒引起陈细胞背损伤壳。例串如肝肚细胞蛮用5疮0g幸×我2m健in宜。取个出上燃清，黄放人器干净这试管捐，并本保持偷0乞℃眨以下焰备用消，加匠入等止量的卫溶液茶至细杠胞沉束淀，桃用漩晋涡混议合器晌混合萍。保浅持在南0毯℃彻以下矛，备甘用。孝芬帝取一同比色清杯，翼加3势ml笋底物笛，5仰0该μ兼l的目NA犁DH堤和2等5~曾20湾0速μ偏l的用样品总(取晶决于缩培养嚷细胞楚的种勇类)拐，迅遣速混狭合后堂，在赛34栗0n繁m处营进行盈比色块。整虹个过额程应歌在3上7卖℃默条件始下完完成。功计算闸上清筒或沉蜡淀(极即溶亮液中梨细胞御)的首LD关H活誓性，棍漏出液率表舰示方圈法为缠培养苦液中墨LD萄H活础性占崭总的移LD虽H活炼性的萄百分今率。蜘孝衬3.萝其钱它方乎法找铬削的释固放，躁利用泛51来Cr垮3+尼可被俘活细铁胞吸宴收，长并还乖原成含51剃Cr龙3+壶，留宫在胞相内，后而死相亡细腔胞则腔释放略51森Cr漠3+纲。用栽r-隶计数瑞器检扛测无素细胞壤上清佣液中晴51举Cr姿3+蜜的量缝，即凝可判硬断培波养细粉胞的而存活取情况灶。还男有贴挖壁效逢率和垄AT古P含津量等私指标哭可鉴味定培巾养细及胞的置存活漫情况异。番驳倦(三泉)斩细胞死特性刊鉴定突社丈在连吴续培祸养期书间，辱细胞坛可能踩发生狂某些笼变化商，如扒细胞竭与原秤始细碗胞的辟差异惠逐渐递加大她。但掘每一威细胞境株具留有一弊系列做细胞集特性传“绣正常译”仁的参恒数，乡可供西鉴定殃评价回。例固如，圾形态塔学参绒数、帜生长造特性贤及染软色体惠分析乘等皆本为细机胞特纹性鉴肯定的狱指标福，其踢中形解态学姜与生个长特挤性的岭测定制相对帝容易健进行霉。腔席望1.膝形叠态学墓检查发消评价兴细胞蚊正常轨与否齐的最饮简单膏方法但是形两态学非检查缠；应叮在每社次传叛代时办用倒预置显渴微镜翁进行醒观察街，最美好拍么照记鱼录细怒胞的逗形态纪。要鄙详细匆地描致述每翅一细抬胞系久的形随态。急若因艺限于握篇幅朱，不姑能详沟述，击可掌湾握两绞个述凶语，梨即息“栋成纤尽维样萄”弊和材“择上皮启样酷”债细胞翁，即绣可描箭述所谜观察蚕的细轻胞。卧成纤超维样番细胞闲系指末在单浇层细恒胞培牲养时抓，细糖胞的缠长度仰要大蜡于其腾宽度珍的两年倍的萌细胞肾，而纷上皮竹样细弱胞系扯指呈赖多角衫形的睬细胞饲。发视篇2.坊生宽长特即性的肤检查霞销在培闯养细慈胞时朱，其哑生长扬特性袄的检疯查较并易进歌行，坑主要羽通过支测定富更换拒培养努液的啦时间豆和传片代的印时间宰来完击成。黎虽然泻不同忠的细羽胞其震传代革时间厅和更虑换培伪养液板的时贤间不磨同，立但对难于每折一细俭胞系犁应该趴较为烈固定害，因仔为主弓要取毛决于少细胞势生长扔速率雷。糟储戴亿丹每个询细胞乌系均他有其壤自己伸的生羽长循周环周核期，胃这取队决于狭接种持进行应培养傻的细难胞数份目。柔一般昨认为部，在梨培养引中的叛细胞粥，是毫处于成不同塘的生擦长阶秀段。受进行闻生长躬分析氏，应染观察冤单个蚕细胞纯的生滩长速营率。厦在实拐际工趋作中冻，是对测定背克隆变效率汽或者饺接种标效率锋。克怕隆效并率是求测定止由单语个细偷胞生瞧长的咐克隆瓣。接黄种效公率是施测定乒植入槐小量套细胞首(2誉~5彩0个晴／c厕m炭2捡)后剪，等患生长难至可何分辨葬的小狠克隆巡时，象经用痛生理塞盐水盆洗涤性，甲吨醇固圣定，岂吉姆醉沙染佣色(厚2m撇l／赏25虾cm奏2修)和躁清水厅冲洗斗后，翁计算娱克隆托数。巨接种宵效率敌=眼巾穴一般最认为唐，传贞代效柴率小植于3碰0表遇示生今长不耕正常恰。此句项指周标可继用于逢正常粒细胞夸生长纺的监桑测，方贮存孝细胞唇的复臭苏及宵鉴定吗每一涌批血省清等眉。断视齿在细蒙胞培撞养试美验中柜，一垂般监简测指毒标可缎采用快形态健学、房生长地模式西及接慈种效楼率即悔可。忘傲批3.紫其欧它检凯查货除沉上述序指标烦外，兵在细洪胞培参养时延，可共进行黄染色销体分趋析，佣包括盆染色缺体的否数目挪和结刃构以斩及D技NA峡、R蛮NA乡和蛋巾白质予的含职量测掀定，极来判秘断培公养细指胞的境特性宴。郑七、特细胞阔培养闲在食骄品毒够理学城中应煤用领泽线利用年培养赔的细南胞，裳可进祸行多写方面酱的毒蚂理学摧研究剪，如臭表1俭2-逃4中螺所列乔。弄表1洞2-扑4崇培影养细狼胞用铸于毒贺理学酬体外吉实验草的实馅例稠面误悄一般屿毒性惊：主客要为卵急性隐细胞奖毒性蒸阀撑器官谦特异车性毒袍性：碰利用辆有代组表性快细胞冷类型伏如肝犯细胞贺、肾吸近曲译小管沟细胞丛、神就经细新胞及柳心肌掏细胞茫等：烂梳沫痰毒作桐用机接理垄龄治两生物瞧转化并、毒功性代住谢产理物的铅形成避虾易绿遗传摩毒性丑，如求程序敬外D值NA朽合成族测定亭覆冶欠繁殖奴毒性艳立搭漆联合倡毒性聚卸签倒不同继物种耗间的西比较缸毒性恒权味绕光敏跟毒性爪杂袍以下轧重点糖讨论胳毒理段学中神应用抓细胞乏培养臣技术借时应颂注意圈的几打个问怖题。税绞倦1.痛细旗胞类熊型的挎选择椅禁细胞序类型划的选药择取乐决于膝实验咐的目室的。锡一般捐性筛雅选系杆列化渔合物链的一邮般毒性性时福，应辫选择闯生长女迅速摔且易赴于处绍理的炭细胞成系。报机理姨研究汇多不故用细网胞系械，因险为培讨养的绍细胞州会逐缓渐丧界失许旬多功笋能，包如细方胞色躁素P吵-4棒50博的活料性。灵制忙战公细胞势培养柏的优平点之劫一是剑可选得择来剧源于翻人体授的组悲织细业胞，六可减来少试壶验结臣果的莫物种朱差异奇。成排纤维机样细配胞和渠上皮誓样细免胞均吉可选骑用。暗常用基的细径胞系蚊有C示HO坐、V爱79榨、H贝el由a、锁BH顷R及灶L9胞29石等。碍田亲2.还代丑谢活广化内细外胞经映8-邻24重h培家养后室，细询胞色故素P阵-4韵50利活性年将迅也速下肿降。歌而在犹CH字O细都胞系绢中，查涉及醋代谢芽活化寻的酶慢活性然下降骡。所护以，傍培养蛇细胞架对需筒代谢充活化泰的化令学物哗不能继够敏轧感。勉谦妨解决久这个户问题豆有两迁个方厦法，思一是累加S秧9，抬二是垒与原惕代肝建细胞栗复合偷培养驴。S意9需泰要N括AD仗PH鸦才具痛有代华谢活坦化作在用，鸭故在嘱培养才液中甜应加残有N贷AD搭PH肌生成娃系统增(葡轮萄糖槐-6勒-磷秀酸脱怀氢酶笋、葡凤萄糖宅-6调-磷柜酸和俱NA指DP榜)。朽与原偿代肝剥细胞苹进行闷复合域培养净时也告可采固用其酸它不稳同的泽细胞占系，甩如V绪79帽、中嚷国地新鼠肺季成纤碑维细叙胞和嫂人成比纤维素细胞数。脸插珠符兴3.蜂受跪试物咳的给彼予许筹多仆受精试物款由于塑水溶陈性较柄低，匀在加身入培格养液躁前，夸常需话溶于盈有机车溶剂吉有机惨溶剂拐对细羞胞有豪损害乔作用折，故顷应限位制有枪机溶追剂浓开度在上1％仿以下泽。在轻试验确中可陵设立冲适当谣的有翻机溶忍剂对杰照和末培养笑液对看照。撇例如捡，需揭用S屠9混南合液糖；有劳机溶盐剂的罪浓度晃应限欧制在扇0.乒1％架，因猜为许日多有吴机溶汇剂可稿抑制磁酶的撑活性稼。不割溶性果的受窑试物唇如，育颗粒逼和油晕剂在于给予虎培养袖液时驳仍存付在问圈题。趣一般命是混剑悬于政培养砌液或蜜者先醋溶于地溶剂吼，再番加人宪培养伴液，挽但有胶时会轿产生劲不同萌的毒猫性结稳果。莲例如射，黄帝樟醚则和降住脂乙煎醚等挑油性肌受试差物，丈假如摸使用杀高剂麦量时详将有在某些咐塑料脆培养昼皿成暑分的菜溶出强，则类所观株察到呢的毒逃性作子用可钞能部属分地蝶是由扬于某万些塑级料成渴分所度致。雕厅圣4.行设扁立阳睡性对矩照组已啊实验什系统耀的重叼现性趣应该射用阳紧性对帅照物悼来检亦查。年阳性茄对照满物指识采用群经过仿研究俊或公飞认有察特定轮作用面的化炎学物绞。例赴如在超代谢某活化联研究英中常努选择坡环磷埋酰胺贼为阳敏性对既照物奶，在因细胞锤毒性悲筛检津时可弹选二沃甲基篇环己汗基烃根乙基淹戊二燕酰亚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