规模化奶牛场牛白血病净化技术规范

规模化奶牛场牛白血病净化技术规范1范围本标准规定了开展牛白血病净化的规模化奶牛场管理措施以及牛白血病净化技术。本标准适用于规模化奶牛场实施针对牛白血病的监测与净化。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB16568奶牛场卫生规范GB4143牛冷冻精液国家标准NY/T574-2002地方流行性牛白血病X脂凝胶免疫扩散试验方法中国动物疫病预防控制中心规模化奶牛场主要动物疫病净化技术指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1规模化奶牛场具有法人资格的年存栏奶牛300头以上的奶牛场。3.2牛白血病由牛白血病病毒引起的一种以淋巴细胞恶性增生，进行性恶病质变化和全身淋巴结肿大为特征的一种慢性、进行性、接触传染性肿瘤病。3.3动物疫病净化在一个养殖场或指定区域内，通过持续监测和监测发现患病动物或带毒动物，并通过淘汰带毒动物以实现根除某种动物疫病的过程。4检测方法4.1X脂凝胶免疫扩散试验检测使用一次性无菌采血设备采集待检牛只血液，分离血清。按照NY/T574-2002检测血清中牛白血病病毒gp51抗原，检测结果为阳性即判定该牛为牛白血病病毒阳性牛。4.2商品化试剂盒检测无菌采集待检牛只血液，分离血清或血浆。使用符合要求的商品化试剂盒按说明检测血清或血浆中牛白血病病毒gp51抗原或牛白血病病毒X2抗体，检测结果为阳性即判定该牛为牛白血病病毒阳性牛。无菌采集待检泌乳牛乳汁，使用符合要求的商品化试剂盒按说明检测乳汁中牛白血病病毒抗体，检测结果为阳性即判定该牛为牛白血病病毒阳性牛。4.3核酸检测使用一次性无菌采血设备采集待检牛只抗凝血，使用商品化全血基因组DNA提取试剂盒按说明提取全血中的DNA。核酸检测操作按照附录A和附录B执行。5净化措施5.1分牧场饲养对牛只实施信息化管理，通过标识佩戴、建立身份档案等途径，对牛只出生、调运、销售、淘汰、死亡进行全程监控。将牛白血病病毒阳性牛隔离至其它牧场，使牛白血病病毒阳性牛集中于一个牧场。按照4所列方法检测牛白血病病毒阳性牛所产犊牛是否感染牛白血病病毒，未感染牛白血病病毒的初生母犊牛应转至阴性牧场饲养（避免采食母牛的初乳）。待牛白血病病毒阳性牛到达使用年限后主动淘汰阳性牛只。5.2环境控制5.2.1阳性隔离场按照GB16548处理牛白血病病毒阳性隔离牧场奶牛血液、分泌物，避免污染牛白血病病毒阴性牧场。严格按照GB16568对牧场进行消毒，降低牛白血病病毒性免疫抑制牛可能发生的其它致病微生物感染。5.2.2阴性牧场按照GB16568对牧场进行消毒，以清除运动场、牛舍、奶厅、器械、空气中可能存在的病毒风险。严格执行卫生防疫制度，严格执行生物安全管理措施，最大限度控制外来人员、车辆、蚊蝇、饲料等风险因素。5.3引种管理购进冷冻精液应选择符合GB4143要求的牛白血病病毒阴性种公牛精液，避免潜在的垂直传播。购进胚胎应来源于牛白血病无疫国家、地区或种畜场。引进奶牛在隔离观察45天后，按照4所列方法检测，多种方法同时确认为阴性牛后方可引入本场。5.4操作管理对牛只进行注射、接产、打耳标、除角操作时，严格落实一牛一针头、一牛一手套和一牛一消毒措施，避免潜在的交叉传播。5.5饲养管理为XX牛白血病病毒阳性牛使用年限，可在饲料中添加适量硒、维生素E、类胡萝卜素，以缓解CD4阳性T淋巴细胞减少症状，提高养殖效益。5.6持续检测与净化牛白血病病毒阴性牧场每年须进行两次牛白血病病毒检测，发现阳性牛应及时分群至隔离牧场。为降低检测成本，使用商品化试剂盒或核酸检测时，可使用10合1混样检测技术进行检测，混样时应注意动作轻柔，避免气溶胶产生。5.7原奶处理阳性隔离场牛乳不得直接饮用和饲喂犊牛，原奶加工时需将阳性隔离场原奶与阴性牧场原奶充分混合并进行均一化处理，并进行超高温瞬时灭菌或巴氏消毒，消除潜在的公共卫生安全风险。6净化标准与维持采取检测、分群、隔离、淘汰相结合的净化措施后，按照《规模化奶牛场主要动物疫病净化技术指南》采样数量要求采集阴性牧场奶牛血液，连续2年牛白血病监测个体阳性率小于0.1%可列为假定阴性群。对净化场开展持续性监测，每年至少进行2次以上全群监测，以维持净化效果、保障牛群健康状态。监测期内发现阳性牛的处置方式同5.1，并应及时分析管理因素和技术因素，加大监测密度，及时开展病原学监测，评估生物安全措施有效性。7注意事项为实现净化目标和维持净化效果，奶牛场开展牛白血病净化之前，应健全生物安全防护设施设备、强化饲养管理、严格执行消毒措施和规范无害化处理措施，构建“规范化、制度化、设施化和无害化”的防疫和生产体系。

附录A（规范性附录）电泳法检测牛白血病病毒囊膜基因核酸操作规范A.1引物序列上游引物序列为5’-CAACCGATCATCAGATGGGTAAG-3’，下游引物序列为5’-CAGGGAGCATCTCCAAGTCTG-3’。A.2核酸扩增反应体系25μL核酸扩增反应体系如下：双蒸水18.3μL，待测DNA样品1.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，耐热缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.0μL，耐热DNA聚合酶0.2μL。A.3核酸扩增反应条件94℃预变性5min；94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸6min。A.4电泳检测制备2.5%X脂糖凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5.0μL扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，加到凝胶孔。加入核酸分子量标准。110V恒压电泳30min，使用凝胶成像系统检测核酸扩增结果。A.5判定标准被检测样品PCR扩增产物出现79bp特异性目的条带，则判定为BLV核酸阳性。必要时可取扩增产物进行测序，与牛白血病病毒囊膜基因序列同源性在95%以上，可确定为阳性。附录B（规范性附录）荧光法检测牛白血病病毒囊膜基因核酸操作规范B.1引物序列上游引物序列为5’-CAACCGATCATCAGATGGGTAAG-3’，下游引物序列为5’-CAGGGAGCATCTCCAAGTCTG-3’，荧光探针序列为5’-FAM-CTCTCCTCGCTCTCTGTC-MGB-3’。B.2核酸扩增反应体系25μL核酸扩增反应体系如下，灭菌双蒸水8.5μL，待测样品2.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针1.0μL，含荧光耐热DNA聚合酶12.5μL。B.3核酸扩增反应条件95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火，复性/延伸30s，循环40次后于60℃时采集荧光信号。B.4判定标准阴性：样品无荧光检测阈值，且无