钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立

史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：://item.taobao/item.htm?id=9176907081钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立龙雁，袁辉，王晓良*中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所先农坛街1号，北京，100050摘要：目的构建三种不同亚型的CHO-NCX稳定转染细胞株，以便筛选可能的钠钙交换体（NCX）调节剂。方法采用脂质体法将NCX目的基因稳定导入CHO细胞中，检测稳定转染细胞株中NCX的蛋白表达和电流大小，并观察温度和NCX抑制剂KB-R7943对电流的影响。结果Westernblot结果显示与CHO-pcDNA3.1空白细胞相比，CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX蛋白的表达量显著升高；电生理结果提示CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX电流远大于CHO-pcDNA3.1空白细胞；温度从22℃升高到35℃时，NCX电流显著增大；NCX抑制剂KB-R7943对INCX具有显著抑制作用。结论本试验成功的建立了特异性表达NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种亚型的细胞模型，为脑缺血等疾病的研究提供了良好的药物筛选平台。关键词：NCX1.1；NCX1.4；NCX1.5；NCX抑制剂KB-R7943；膜片钳EstablishmentandEvalutionofCellModelTargetedatSodium-CalciumExchangerLongYan,YuanHui,WangXiaoliang(InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)ABSTRAT:OBJECTIVETodeveloppotentialNCXmodulatorwith3differentkindsofCHO-NCXcellswhichstablyexpressedNCXproteins.METHODSTheNCXgeneswereligatedwithpcDNA3.1+vectorandthenstablyintroducedintoCHOcellsbyliposome.UsingwesternblotandpatchclamptechniquetomeasuretheexpressionlevelsofNCXproteinsandNCXcurrents,afterwhichtoobservethemagnitudeofNCXcurrentswhentemperaturechangedandNCXinhibitorutilized.RESULTSComparedwithblankCHO-pcDNA3.1cells,theproteinamountsofstablytransfectedCHO-NCXcellsweresignificantlyincreased;thecurrentsofCHO-NCXcellsweremuchhigherthanthatofblankCHO-pcDNA3.1cells.Whentemperaturechangedfrom22℃to35℃,thecurrentsofCHO-NCXcellsup-regulatednotably,afterNCXinhibitorKB-R7943added,thecurrentsofCHO-NCXcellsdecreasedsignificantly.CONCLUSIONOurstudysuccessfullyconstructedacellmodelwhichexpressedaspecifickindofNCXisoforminCHOcells,whichprovidedausefultooltosearchnewdrugsofcerebralischemiatargetedatNCX.KEYWORDS:NCX1.1;NCX1.4;NCX1.5;NCXinhibitorKB-R7943;patchclamp作者简介钠钙交换体（NCX）是细胞膜上具有9个跨膜片段的一种双向转运体，根据细胞膜内外离子浓度梯度和膜电位的不同，NCX可以通过正向转运（Ca2+外流）或者反向转运（Ca2+内流）两种转运方式将Na+和Ca2+以3：1或者4：1的比例进行交换，从而维持细胞内Ca2+的稳定[1-3]。生理状态下，NCX主要利用细胞内外的Na+浓度梯度排出细胞中的Ca2+[4]，而在病理状态下，当细胞内Na+浓度升高时，NCX反向转运可以导致细胞内钙超载。近年来越来越多的研究表明NCX与脑缺血关系非常密切，但结论并不一致。有的研究者认为抑制NCX反向转运具有脑保护作用，而有的研究者却认为激活NCX的反向转运可以有效保护神经元[5]。此外，在低氧缺氧，脊髓损伤后的白质退行性病变，大脑损伤，视神经损伤，神经元调亡，衰老和阿尔兹海默病等相关疾病中，也有研究提示NCX可能发挥了重要的作用[6]。由于NCX具有重要的生理和病理学意义，自1968年Baker等人首次报道NCX的存在以来，一直是人们研究的热点。内容包括NCX的分布表达，活性调节，结构-功能关系以及在疾病过程中的作用等方面，研究手段包括RNA/蛋白水平定位，反义寡核苷酸/RNAi技术，制备基因敲除小鼠等。但研究结果发现反义寡核苷酸技术仅在体外可行，体内无效[7-9]，NCX1基因敲除小鼠在胚胎状态则已死亡[10]。因此，在这种情况下，急需研发一种选择性的NCX抑制剂以便观察NCX的作用。比较遗憾的是，至今为止还没有找到具有高特异性的化合物，也没有以NCX为靶点的临床药物上市。哺乳动物细胞中共有三种NCX亚型，NCX1在体内广泛存在，主要位于脑，心脏，肾脏等部位，在上述组织中，已检测到7种NCX1剪切产物，其中，NCX1.1主要位于心脏，NCX1.4，NCX1.5和NCX1.6主要分布在大脑，其余三种剪切产物。NCX2和NCX3仅在脑和骨骼肌中有表达，其中NCX3有3种剪切产物，而至今未检测到NCX2的选择性剪切产物[6]。此外，各种NCX亚型具有不同的分布特性，这提示不同的NCX亚型在脑缺血中的作用可能不同。同时，NCX还具有双向转运特性，这也增加了以NCX为靶点进行药物开发的难度。因此，在筛选以NCX为靶点的化合物时，必需观察化合物对不同的选择性剪切产物及其转运方式的影响。基于上述原因，本试验将NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种质粒通过脂质体转染的方法稳定导入CHO细胞中，建立特异性表达NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种亚型的细胞模型，并观察了温度与NCX抑制剂KB-R7943对INCX的影响，希望通过该细胞膜型筛选化合物以便开发新型的NCX调节剂。ABAB揭F墙ig酬1.曾S割tr猫uc园tu煮re电s裂of呆p遮cD览NA喷3.糟1+粉a谣nd寺p查cD黎NA高3.来1傲+副/N脚CX容p滩la庸sm梁id饰s.悠(拔A)鞋S粗tr汪uc陡tu缝re厕o锁f肢bl菜an即k锈pc塘DN耍A3耳.1垄+柴p伐la向sm洁id胞.葱(B可)喂St订ru歪ct搅ur色e粉of台p歉cD可NA愈3.料1唱+孔/N傲CX饰p吗la程sm凭id脆s辰af互te毒r评do亩ub尝le粱d纯ig马es展ti储on冶a贩nd太s川ub盈se验qu盛en偷t偿in奏se息rt斜io竟n兰of页N熔CX历g流en笋es尊t戴o等Hi愚nd锅叶Ⅲ典a痕nd份B秋am新H叮Ⅰ粘s宽it锋e.穴图1暂.冷pc斩DN恩A3苹.1朱+和喉pc饶DN必A3饶.1情+趴/N活CX惠质粒兰结构珠图。芦(A野)为苦pc壤DN愉A3都.1临+质殿粒结港构，意(B禽)为旬pc矩DN默A3纵.1貌+布/N子CX肚质粒拜结构络，你用H俗in培d魄Ⅲ和猛Ba请mH捞片Ⅰ双趋酶切放，再推插入菠三种弦不同房的成NC雄X歪目的考基因予。腐1、挠质粒就鉴定蒸结果股：12345215000bp210000bp27500bp25000bp22500bp21000bp赶（1浑）酶喊切：输将臭pc叉DN学A3秧.1宣+质车粒，舞NC真X1狸.1硬，N蛾CX点1.铃4以痒及N棵CX守1.勇5芦质粒耕用谈Ba委mH赞I碗和喇Hi衣nd桌Ⅲ咱分别炭进行胀酶切耀，切酶切晴产物昆用敲112345215000bp210000bp27500bp25000bp22500bp21000bp伶F资ig拾2茄.填An雕al沉ys聚is苍o通f润Ba进mH森否Ⅰ卖a殖nd笛H叶in徒d蚀Ⅲ耳t通re祸at推ed股pc倾DN劲A3雄.1贴+狱pl龙as冤mi丑d四on典源1%孟et们hi振di臣um锈b选ro赚mi手de摄-s屿ta境in冒ed男a缴ga碎ro驻se灯g沿el配.倡Li举ne雹弦1居:议si匆ng泄le肉d甜ig胆es明ti检on铜p辱ro搂du档ct急o智f蜡pc笼DN补A3补.院1+税v片ec宗to舅r腿by朗H厦in冰d宝Ⅲ森;可Li拜ne阴陪2由:演si猫ng麦le抛d茄ig浅es稼ti震on腰p而ro跨du洁ct坑o岸f腔pc使DN萝A3车.1扔+处ve叙ct仓or就b秩y侍Ba乏mH摘Ⅰ担;烛Li哭ne鸽烧3皮:廊do肌ub婆le禾d霞ig拦es倦ti撇on祝p砌ro梨du叙ct内o滑f代pc廊DN织A3陪.1走+絮ve硬ct集or司b界y社Ba驰mH悔Ⅰ厅an睡d俘Hi旺nd登Ⅲ金;蚕Li户ne茶绑4铸:贩un园tr蔑ea舅te拘d伍pc附DN碧A3壶.1野+慢ve军ct帆or踩;捐Li巨ne描5暂:躬Ma妨rk酱er些;过图断2渴.兆应膊用晚Ba炸mH愧Ⅰ踏和H稳in可d稻Ⅲ双追酶切俘法对收pc至DN央A3锐.1嘱+帜载体眨进行爆分析垦鉴定凝。条饰带1钞：拼Hi钩nd术Ⅲ愁单酶宏切呢；条停带2训：伙Ba徒mH怜Ⅰ皮单酶歼切斗；条款带3择：信Ba捏mH闷Ⅰ净和H亡in骗d陈Ⅲ双寺酶切盈；条高带4侧：缸未处剑理的良pc购DN吵A3闲.1兆+载续体启；条全带5查：修分子果量M固ar奖ke叔r鬼。拍如图妈所示税，接pc铁DN杂A3口.1驼+叛质粒卵载体谁（贱54护28索b弃p刻）适中分桥别包兄含一引个机限制曾性内听切酶趴Ba厚mH闻销Ⅰ脂和H素in爪d问Ⅲ倚的酶熟切位岁点，锁单棒酶切疲后贡生成优约植5.懂4宰kb搞的单堡链，淹符合膨理论船值。千而辉pc残DN青A3骄.1轨+侮载体乘上的芝Ba懒mH茧粱Ⅰ越和H题in镜d匆Ⅲ的斧酶切仪位点泽相隔砍仅撒18较b平p感，锅其中吓18扭b勇p粘片段墨过小材未能鼻显示图，另忧一片绩段大峰小约案5.降4条kb匹。线完整印的券pc摇DN须A3元.1陈+上质粒类载体炊包含筝多种勿构像剧，从奔而出亡现多提条条废带。223451215000bp210000bp27500bp25000bp22500bp21000bp2250bp岗Fi狂g役3柏.吹An哀al腊ys姑is瓦o防f晴Ba改mH罪尸Ⅰ汽a劲nd范H油in耕d阵Ⅲ康t点re懂at貌ed食至ra支t作NC肾X1折.1傍p傍la奸sm比id尸o惕n状1%众e也th赔id乞iu瓦m狸br贞om蔽id凑e-它st危ai狡ne锻d炕ag泡ar门os洽e痕ge坐l.无L窃in爱e坐1:拐d焰ou要bl读e卧di蛇ge止st霜io池n景pr材od章uc牌t恐of凑N点CX竟1.覆1是by而B沿am妻H仔Ⅰa策nd锤H优in前d村Ⅲ;飞L羽in垦e脉2:殿s温in金gl粗e侵di物ge存st肿io碍n饺pr疮od恩uc望t弟of捞N宣CX趁1.寇1临by捎H六in测d立Ⅲ辆;埋Li篇ne瓦3冒:甩si滤ng信le啦d闹ig劈es开ti贫on丝p俭ro坑du巡ct耕o美f课NC狮X1月.1朗b散y慕B饿am射H厌Ⅰ庭;缝Li鞋ne虽4鼻:均un俭tr连ea船te哲d救NC摧X1活.1艺p盏la坐sm饼id好;羽Li伙ne滤5肠:欣Ma亲rk洞er咸.抵图壮3平.席应筒用粉Ba土mH燕Ⅰ创和H挂in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