药典微生物限度检查法操作要点

05版药典微生物限度检查法操作要点林丽英05版药典微生物限度检查法与以往药典的最大不同就是多了方法验证。由于以前版本的药典没有要求对检验方法进行必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不好难操作。为了更好执行05版药典，现根据我的理解，对药典上的各种检验方法在验证时的操作要点与大家作个探讨。一、验证的目的由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果，将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。对所建立的微生物限度检查法进行验证的目的，就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。细菌计数验证所用的菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]：代表革兰阴性菌；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]：代表革兰阳性球菌；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]：代表革兰阳性杆菌；霉菌计数验证所用的菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98001]：代表酵母菌；黑曲霉[CMCC（F）98003：代表霉菌；由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均达到要求，才表明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否则，所得的结果是不能真实地反映样品的污染情况的。菌液的制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～l00cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出胞子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。二、方法的验证所有验证方法的操作均应在阳性接种间。（一）、细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证验证方法取试验可能用的最低稀释级供试液进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。霸阔1．改常规三法倚就是狸取1摊:1是0的渴供试赛液1且ml警和5挡0~本10革0个例试验论菌株欢加入还到1脊个平象皿中石，立芳即倾脑注相乔应的哨琼脂楼培养追基，灰每株夫试验朝菌平酬行制跳备2滤个平杜皿，锦培养武，计缩算各压菌株视的回江收率牢。稳常规晓法做谊一个谦样品枝的细肢菌、孔霉菌剂和酵汁母菌票计数浸验证阻试验鼓，需烦要多歇少个场平皿魔呢？瓶试验朗组：忙5慨×惠2=锦10相个价，即织每个蜜菌株寄做2膜ml衣共需退10统个；缝菌液卧组：沿5屿×礼2=掀10鱼个，默即每丘个菌律株的真加菌直量，暖每株承2个旺皿。叙乓共戴24村个蓝本底输菌组隶：2底个细钟菌计赴数，并2个围霉菌基和酵草母菌驱计数缠。毁细菌妙计数扰验证统所用茎的平裤皿共斯14忆个，例其中占6个衡用于高试验鸣组计秒数，著6个分用于勺菌液刻组计扮数，恶2个皂用于搏细菌仔本底均菌计泪数，用倾倒里营养砖琼脂屠培养剃基；镜霉菌时和酵旨母菌瓶计数崇所用撇的平贵皿共漆10截个，者其中截4个初用于葵试验松组计谜数，应4个保用于质菌液毫组计非数，贵2个币用于熟霉菌朗本底承菌计监数，贡倾注著玫瑰皇红钠呀琼脂血培养控基（叔虎红先琼脂怕培养麻基）暮。鼻回收园率=洋[(睡试验炕组菌百数-肝本底烈菌组撑菌数巧)/船菌液怎组菌敬数]幻当大茄肠埃科希菌仙，金峡黄色颜葡萄逼球菌巾，枯谢草杆绪菌3闹个菌据株的虚回收休率均源达到佛70浓%以灿上时均，细坑菌计艰数用僚该验贸证的汇方法若检验屯。殖当白舟色念柱珠菌震和黑科曲霉被2个央菌株棋的回席收率艇均达着到7拾0%专以上挑时，焰霉菌政计数绸用该踏验证忠的方话法检荣验。竞2．减培养框基稀腹释法腊取规倒定量铅的供聚试液乘，至架较大顺量的轮培养阳基中扒，使刻单位踪体积猾内的秒供试该品含诞量减帮少，诊至不浇含抑毛菌作好用。芳测定萍细菌墙、霉升菌及门酵母杏菌的膝菌数怪时，夏取同广稀释都级的兰供试娇液2宵ml谜，每阿lm循l供常试液本可等枕量分批注多北个平鸟皿，高倾注交琼脂后培养锅基，冶混匀链，凝搜固，剖培养权，计级数。贵每l哪ml侦供试境液所康注的环平皿拿中生溉长的骆菌数条之和行即为冈lm列l的臂菌落层数，雀计算把每1形ml漏供试宾液的助平均绣菌落铲数，扒按平禽皿法搅计数拨规则蓬报告喘菌数赞；控概制菌交检查氧时，连可加神大增黎菌培柏养基炼的用历量。肉具体都操作抹：（狐以1产ml胸分至娇5个立皿为嗽例）析就是软取1宵:1陷0的牌供试弱液1酷ml半均匀历分注利到5课个平篮皿中歉，每床个皿浅0.平2m局l，扬每株单试验桑菌平鸦行制打备2变ml撒的平多皿数吓，然猫后加合入相枝应的辞琼脂念培养法基，恢培养迟，计广算各絮菌株泄的回欲收率毕。弓用该悼法做塑一个缓样品拉的细逼菌、掀霉菌所和酵踏母菌许计数流验证间试验鸽，需炸要多驰少个女平皿阵呢？灿试验信组：拨5引×吩10材=5搬0个机，即族每个络菌株凯做2痕ml挡共需苗50弦个；喘菌液蜡组：井5针×匙2=点10缴个，致即每辨个菌叹株的惧加菌雅量，挽每株毙2个阵皿。害肠共猪80反个翁本底存菌组沫：1乌0个雾细菌闸计数皆，1枯0个湖霉菌蚊和酵辟母菌抬计数听。耻3．顿离心兽沉淀放集菌罪法冲取一右定量敏的供粗试液犁，3矩00挪0转题/分扯离心硬20卷分钟斧(供和试液棵如有娘沉淀训，先脚以5桃00符转/齿分离醉心5奋分钟盖，取啄全部尽上清够液再红离心挂)芝,弃成去上影清液吧，留类底部页集菌芳液约膨2m则l，害加稀窑释液膝补至贪原量兼。然菊后用觉此稀絮释液诞进行险检验辰。挺4．翁薄膜闪过滤蠢法挺取相碑当于纯每张宏滤膜偷含1玻g或慈lm表l供兼试品背的供尝试液损，加境至适尺量的产稀释哥剂中霜，混均匀，梦过滤堤。若炎供试鹅品每不1g伤或l椒ml粗所含刘的菌而数较回多时堤，可鹅取适拐宜稀岂释级评的供捧试液饭lm敬l，蝶过滤杨。用馆pH博7.陵0无锈菌氯祖化钠盯-蛋宗白胨作缓冲碑液或蹈其他佣适宜伍的冲袄洗液惧冲洗派滤膜效。冲执洗后师取出失滤膜员，菌霉面朝兆上贴被于营糟养琼南脂培之养基银或真糟菌琼旨脂培赚养上会。每缎种菌当株至替少制挑备一陆张滤爪膜。遮即每兆个验串证样切品至械少制轰备7喝个膜毕。（块5个腔试验止组和毕2个皆本底啊菌）填（二尼）控胁制菌鹿检查参方法乳的验奋证御搜矛验证押时，眼依各刻品种煎项下乏微生烟物限鞋度标狐准中蜜规定饱检查秆的控披制菌胃选择柴相应咳验证佛的菌贫株，孔验证知大肠件菌群摄检查选法时丰，应剪采用医大肠温埃希考菌作刺为验缎证菌热株。命验证臭试验用按供许试液薄的制尸备和午控制于菌检邻查法嚼的规庭定及甲下列狼要求疫进行据。笑菌种扶脏对试典验菌苍种的毕要求侮同细趣菌、笑霉菌言及酵希母菌变计数获方法锅的验僵证。挨印神大肠胁埃希庸菌(危Es责ch枣er画ic逼hi是ac狗ol柏i)浆[C辫MC岗C(趁B)犁44侨1洁02裁]饮拜量金黄士色葡老萄球杂菌(蹄St捞ap大hy单lo骡c名oc爹cu序s愤au马re夏us仰)(喂CM痰CC刷(B崇)好26其0代03掀)念直苍乙型此付伤犁寒沙队门菌鞋(S荒al蜓mo补ne湿ll用a善pa订ra蚀ty从ph城i禾B)手(C边MC只C懂(B秒)5糊0并09唉4)就述罪铜绿着假单聪胞菌傻(P满se痒ud恰om助on衔as旗a倦er谊ug温mo患sa奥)(春CM唯CC活(B禾)给10法1吉04膨)交生孢舱梭菌露(C念lo勺st俱ri赌di狱um虏sp迷or狼og警en穴es桃)(伐CM着CC仍(B愈)6攻4觉94矿1她)渔菌液勉制备讨鸣接种翠大肠厅埃希伪菌、纪金黄顺色葡接萄球尘菌、边乙型福付伤第寒沙目门菌刻、铜饿绿假拐单胞耐菌的敞新鲜艳培养寄物至碑营养屿肉汤犁培养注基或衰营养甜琼脂刻培养玩基中馋，生开孢梭观菌的枕新鲜竿培养猜物至其硫乙央醇酸胀盐流舍体培丸养基造中，猜培养普18见～2狮4小令时。祥用0膀.9抛％无爷菌氯军化钠鼠溶液痕制成扒每l坚ml歼含菌春数为指10取~l泪00色cf傅u的芽菌悬哀液。洒验证象方法长（1把）试霞验组括启取规毅定量蓄供试冰液及碧10跪~1尼00慧cf优u试亲验菌盘加入我增菌拣培养投基中教，依楼相应莲控制葬菌检影查法眠进行佣检查滋。当山采用畅薄膜仍过滤旺法时殃，取铅规定屋量供那试液傅，过迈滤，嗓冲洗失，试驼验菌董应加烧在最膊后一带次冲正洗液蔑中，孝过滤今后，镜注入躺增菌催培养喷基或教取出互滤膜贡接入街增菌搞培养败基中感。谁（2貌）阴司性菌磨对照嚷组翁设舞立阴劝性菌唇对照渠组是锈为了岸验证陪该控甲制菌暖检查灭方法蛮的专两属性搭。方暑法同蹈试验鞋组，除验证台大肠泻埃希跳菌、士大肠佣菌群收、沙瞒门菌族检查馅法时秧的阴集性对宫照菌仁采用便金黄感色葡拾萄球翅菌；修验证罢铜绿冈假单初胞菌房、金徐黄色博葡萄扯球菌瓜、梭棚菌检到查法陶时的司阴性现对照踪菌采运用大潮肠埃钱希菌属。阴赴性对抢照菌刷不得袖检出般。评结果椒判断之愉阴性段菌对草照组比不得谱检出标阴性草对照壤菌。麦若试绳验组基检出寨试验雄菌，铸按此坊供试拴液制很备法干和控食制菌吊检查葵法进雷行供化试品钟的该组控制尾菌检胀查；白若试絮验组序未检息出试上验菌练，应蜂采用版培养柜基稀灰释法帜、离翻心沉蝇淀集吼菌法光、薄咸膜过行滤法建、中气和法形等方腊法或匙联合值使用另这些添方法迟消除址供试解品的坏抑菌焰活性哥，并夜重新旗进行爬方法堂验证划。揭三、铸检验动方法瘦（一钳）计嫌数法珍的检敌验岭计数越方法匹包括袄平皿内法和刻薄膜典过滤裹法。唐检查魂时，布按已蒸验证抹的计矩数方禾法进捞行供皮试品菊的细蓝菌、蹦霉菌定及酵头母菌岩菌数原的测扫定。袭1．锣平皿扰法灾常规稳法和肠培养命基稀隐释法旨都是蕉平皿升法。妻供试饿液通笔过离脊心沉祸淀以直后也键可用物平皿特法检陷查。优采用民平皿纤法进粗行菌顿数测绝定时耽，应煤取适形宜的垦连续很2～燕3个遭稀释馅级的估供试衡液。浑取供扰试液载lm认l，控置直次径9浅0m向m的睁无菌比平皿鉴中（析培养酬基稀住释法安，则钢将1懂ml谈供试谎液均赌匀分学注入候2个糕或以毕上的积平皿绢中）盛，注角入1中5~宗20夸ml售温度可不超遣过4粗5义℃愉的溶湾化的贿营养手琼脂六培养丑基或蒜玫瑰扬红钠茅琼脂榆培养疼基或逮酵母潜浸出躬粉胨求葡萄术糖琼窜脂培隐养基伪，混状匀，芽凝固沿，倒腿置培良养。扮每稀柳释级扭每种络培养乓基至纪少制如备2待个平刃板。史阴性堤对照赶试验贺燥取试疤验用碰的稀雾释液崇lm汁l，缎置无康菌平么皿中界，注腊入培肯养基感，凝熄固，间倒置员培养旁。每医种计当数用寻的吹培养稿基各计制备检2个逗平板傍，均端不得寺有菌据生长汪。纠培养兵和计色数眠容除另肠有规剥定外层，细沙菌培劈养4悄8小机时，颤逐日犹点计择菌落猛数，摧一般纠以4侍8小楚时的笋菌落包数报陆告；血霉菌硬、酵队母菌趋培养昨72说小时邮，逐天日点千计菌玩落数贸，一为般以忽72膏小时展的菌袖落数衣报告爪；必粱要时罗，可仿适当搬延长扎培养所时间齿至5购～7步天进徒行菌崭落汁轰数并呆报告坝。菌肌落蔓烧延生议长成龟片的抬平板草不宜移计数羽。点烧计菌百落数蚀后，朱计算侨各稀息释级械供试燕液的染平均童菌落偿数，写按菌焰数报龟告规醋则报删告菌孔数。服若同均稀释讲级两惧个平煎板的伟菌落帝平均鸦数不傻小于绢15叫，则誉两个寿平板重的菌源落数岂不能廊相差桨1倍对或以机上。歼一般离营养淋琼脂识培养近基用谣于细惧菌计恩数；尚玫瑰轿红钠动琼脂紫培养币基用污于霉够菌及兼酵母瑞菌计尸数；斩酵母间浸出中粉胨现葡萄更糖琼漆脂培蜜养基斧用于穷酵母谢菌计他数。舰在特伙殊情声况下寺，若联营养听琼脂例培养应基上筛长有雀霉菌仓和酵蜘母菌另、玫兄瑰红拴钠琼宝脂培席养基糠上长渔有细米菌，杯则应那分别餐点汁寒霉菌召和酵研母菌卸、细亡菌菌元落数司。然毅后将触营养陪琼脂著培养封基上毛的霉洽菌和姓酵母互菌数敲或玫摔瑰红懒钠琼从脂培辫养基兴上的底细菌贷数，铸与玫困瑰红稿钠琼勾脂培到养基灯中的度霉菌棒和酵玉母菌羽数或婶营养退琼脂锐培养妄基中沙的细住菌数蓬进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