第四章抗体工程修改后演示文稿

第四章抗体工程修改后演示文稿当前第1页\共有87页\编于星期六\18点优选第四章抗体工程修改后当前第2页\共有87页\编于星期六\18点第三节基因工程抗体制备一、人源化抗体二、小分子抗体三、抗体融合蛋白四、双特异性抗体五、噬菌体抗体库技术第四节单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂二、蛋白质的提纯三、小分子抗体的应用四、抗体融合蛋白的应用五、双特异抗体的应用六、抗体库技术的应用和前景思考题小结当前第3页\共有87页\编于星期六\18点

第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤

细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤

细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体当前第4页\共有87页\编于星期六\18点抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)当前第5页\共有87页\编于星期六\18点B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体当前第6页\共有87页\编于星期六\18点流程一、杂交瘤技术当前第7页\共有87页\编于星期六\18点不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞当前第8页\共有87页\编于星期六\18点

动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重（二）免疫脾细胞当前第9页\共有87页\编于星期六\18点细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠当前第10页\共有87页\编于星期六\18点。淋巴细胞当前第11页\共有87页\编于星期六\18点。淋巴细胞发育当前第12页\共有87页\编于星期六\18点。浆细胞当前第13页\共有87页\编于星期六\18点。抗原接种当前第14页\共有87页\编于星期六\18点培养液：RPM1640培养液DMEM培养液（三）细胞融合当前第15页\共有87页\编于星期六\18点细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同当前第16页\共有87页\编于星期六\18点培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：1×108的淋巴细胞无菌手术当前第17页\共有87页\编于星期六\18点饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化当前第18页\共有87页\编于星期六\18点。饲养细胞当前第19页\共有87页\编于星期六\18点骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液融合方法当前第20页\共有87页\编于星期六\18点SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培养液细胞融合当前第21页\共有87页\编于星期六\18点10～20天出现克隆HAT筛选挑克隆融合细胞的早期培养当前第22页\共有87页\编于星期六\18点HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：8-杂氮鸟嘌呤聚乙二醇当前第23页\共有87页\编于星期六\18点HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA当前第24页\共有87页\编于星期六\18点HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻当前第25页\共有87页\编于星期六\18点SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞当前第26页\共有87页\编于星期六\18点杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力当前第27页\共有87页\编于星期六\18点有限稀释法(limitingdilution)

显微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)

二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存当前第28页\共有87页\编于星期六\18点特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法当前第29页\共有87页\编于星期六\18点效率最高价格昂贵FACS当前第30页\共有87页\编于星期六\18点配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏当前第31页\共有87页\编于星期六\18点防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义当前第32页\共有87页\编于星期六\18点

第二节单克隆抗体的制备

经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。当前第33页\共有87页\编于星期六\18点一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只体外培养法：中空纤维培养系统

单抗含量不高，牛血清Ab难以去除当前第34页\共有87页\编于星期六\18点腹腔注射法当前第35页\共有87页\编于星期六\18点前5天进行,预先腹腔注射pristane（1～5）×106细胞1～3w形成腹水高滴度腹水当前第36页\共有87页\编于星期六\18点可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）二、 单克隆抗体的纯化当前第37页\共有87页\编于星期六\18点ELISA当前第38页\共有87页\编于星期六\18点ELISA当前第39页\共有87页\编于星期六\18点多头加样枪当前第40页\共有87页\编于星期六\18点。免疫荧光法当前第41页\共有87页\编于星期六\18点盐析沉淀亲和层析离子交换层析McAb的纯化当前第42页\共有87页\编于星期六\18点Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示

表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞

争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 单克隆抗体的性质鉴定当前第43页\共有87页\编于星期六\18点四、单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性（一）单克隆抗体的特性当前第44页\共有87页\编于星期六\18点优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（二）单克隆抗体的优点与局限性局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高当前第45页\共有87页\编于星期六\18点

McAb

PcAb

抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低

稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较当前第46页\共有87页\编于星期六\18点McAbandPcAb当前第47页\共有87页\编于星期六\18点第三节基因工程抗体制备基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)

根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。当前第48页\共有87页\编于星期六\18点当前第49页\共有87页\编于星期六\18点AntibodyIgGstructure当前第50页\共有87页\编于星期六\18点CLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3当前第51页\共有87页\编于星期六\18点VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFc当前第52页\共有87页\编于星期六\18点VHVLCLCH1CH2CH3当前第53页\共有87页\编于星期六\18点VHVLCLCH1CH2CH3Fv当前第54页\共有87页\编于星期六\18点FvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable当前第55页\共有87页\编于星期六\18点

将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体一、人源化抗体当前第56页\共有87页\编于星期六\18点方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体当前第57页\共有87页\编于星期六\18点嵌合抗体当前第58页\共有87页\编于星期六\18点当前第59页\共有87页\编于星期六\18点定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗（二）改型抗体当前第60页\共有87页\编于星期六\18点当前第61页\共有87页\编于星期六\18点Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体

二、小分子抗体当前第62页\共有87页\编于星期六\18点小分子抗体当前第63页\共有87页\编于星期六\18点当前第64页\共有87页\编于星期六\18点其它生物活性蛋白融合三、抗体融合蛋白当前第65页\共有87页\编于星期六\18点许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。四、双特异性抗体当前第66页\共有87页\编于星期六\18点

分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。化学交联BsAb当前第67页\共有87页\编于星期六\18点

将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。细胞工程BsAb当前第68页\共有87页\编于星期六\18点

多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。基因工程BsAb当前第69页\共有87页\编于星期六\18点定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性

五、噬菌体抗体库技术当前第70页\共有87页\编于星期六\18点用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序当前第71页\共有87页\编于星期六\18点噬菌体抗体库当前第72页\共有87页\编于星期六\18点从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库当前第73页\共有87页\编于星期六\18点模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性（二）噬菌体抗体库技术的特点当前第74页\共有87页\编于星期六\18点避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体当前第75页\共有87页\编于星期六\18点第四节单克隆抗体的应用检验医学诊断试剂蛋白质的提纯小分子抗体的应用抗体融合蛋白的应用双特异抗体的应用抗体库技术的应用和前景当前第76页\共有87页\编于星期六\18点病原微生物抗原、抗体的检测肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的的检测激素测定细胞因子的测定一、检验医学诊断试剂当前第77页\共有87页\编于星期六\18点病原体测定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒细胞表面CD测定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型当前第78页\共有87页\编于星期六\18点激素的测定：

内分泌疾病的诊断药物测定(TDM)：抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛研究工作中的探针：越来越多未知功能cDNA的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加当前第79页\共有87页\编于星期六\18点免疫沉淀当前第80页\共有87页\编于星期六\18点二、蛋白质的提纯

单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个