北中大中药化学实验指导03综合实验项目-2银翘散抗流感病毒有效组分研究

实验二银翘散抗流感病毒有效组分研究银翘散为清代医家吴鞠通根据《内经》“风淫于内，治以辛凉，佐以苦甘;热淫于内，治以咸寒，佐以甘苦”的理论而创制的名方，临床应用已久，由金银花、连翘、牛蒡子、甘草、薄荷、荆芥、桔梗、淡豆豉、淡竹叶等9味药组成。始见于1788年出版的《温病条辩》。现代用于治疗流行性感冒、急性扁桃体炎、咽峡疱疹、麻疹、腮腺炎、乙脑、流脑、大叶性肺炎等疾病的初期阶段。现代药理实验表明银翘散具有良好的抗流感病毒活性。石任兵教授课题组以银翘散全方为研究对象，按传统用药方式，结合药效学实验，综合运用现代分离技术和方法，初步阐明了银翘散抗流感病毒作用的物质基础，并初步探讨了其作用机理。一、银翘散抗流感病毒有效组分群的筛选取银翘散原方(金银花:连翘:牛蒡子:甘草:薄荷:荆芥:桔梗:淡豆豉:淡竹叶为9:9:9:5:6:6:6:6:4)按传统用药方式，以水煎煮，得到水煎液。水煎液经过AB-8型大孔树脂柱处理，通过正交实验筛选，以抗甲型、乙型流感病毒为活性评价指标，采用鸡胚法和CPE法，筛选出了银翘散抗流感病毒有效组分群(EFY)。二、银翘散抗流感病毒有效组分群化学成分的结构鉴定采用多种分离纯化方法和结构鉴定手段，对银翘散抗流感病毒有效组分群(EFY)中化学成分的系统研究，从中分离得到43个化合物，并对其中的31个进行了鉴定。1个为新化合物，8个为首次从银翘散中分得的已知化合物，其余为银翘散各单味药已有报道的化合物。1.仪器与试剂HMK显微熔点仪（温度计未校正）。TU1201型紫外可见分光光度计和U2000紫外分光光度计。NicoletImpact410型红外分光光度计，KBr压片。JEOL-300型核磁共振仪、VarianGemini-300型核磁共振仪和BrukerAVANC-EDRX-500超导核磁共振仪。VG-ZAB-HS型质谱仪、VG-20-250型质谱仪、Mariner质谱仪和APEXⅡFT-ICR质谱仪。XZ-7旋转蒸发器（中国科学院生物物理所科龙仪器厂）。SHZ-3循环水真空泵(河南省巩义市英峪电子仪器厂)。H66025超声波清洗仪（无锡市超声电子设备厂）。DS-Ⅱ电热三用水箱（北京市医疗设备厂）。WatersDeltaPerp3000制备液相色谱仪，Waters484可调波长紫外检测器。Waters745数据记录仪,流动相：甲醇-水系统。Gilson制备液相色谱仪，Gilson306泵，Gilson118紫外/可见检测器，Gilson712化学工作站,流动相：甲醇-水系统。薄层层析和柱层析硅胶（青岛海洋化工厂出品）。薄层展开系统:氯仿-甲醇。Sep-hadexLH-20（上海化学试剂采购供应站分装厂产品）。AB-8型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂出品）。柱层析聚酰胺（上海化学试剂公司出品）。聚酰胺-6-薄膜（浙江四青生化材料厂产品）。展开系统：甲醇一水（4:1）。显色剂：10%硫酸乙醇溶液；1%三氯化铝乙醇溶液。所用有机溶剂均为分析纯。2.提取分离流程银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）经AB-8型大孔吸附树脂处理，水-乙醇梯度洗脱，分别得到30%、50%、70%和95%乙醇部分。各部分分别经聚酰胺柱层析，水-乙醇梯度洗脱，聚酰胺薄膜检测，合并相同组分.合并后的组分再行反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱；SephadexLH-20柱层析，甲醇-水不同比例洗脱；硅胶薄层制备，氯仿-甲醇系统展开；HPLC制备，甲醇-水系统作为流动相。最后从95%乙醇部分中得到4个单体化合物;从70%乙醇部分得到5个单体化合物；从50%乙醇部分得到18个单体化合物;从30%乙醇部分得到16个单体化合物。具体分离流程如下:3.银翘散抗流感病毒有效组分群化学成分的结构鉴定通过对银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）中化学成分的系统研究，从中分离得到43个化合物，经理化常数测定及光谱解析，鉴定出其中的31个化合物，其中黄酮类17个、木脂素类3个、酚酸类5个和三萜类4个，其它2个。现以30%乙醇部分分得的化合物A为例说明结构鉴定的一般过程。A为黄色结晶性粉末，mp219-222℃，Mg-HCl反应及Molish反应均呈阳性，酸水解检出半乳糖，示为黄酮苷类化合物。FAB-MS给出准分子离子峰m/z465（M+l）和碎片峰m/z303（M-Gal+1），结合1H和13CNMR数据推断分子式C21H32O12。据此计算不饱和度为12，推知A可能为单半乳糖苷。IR光谱（KBr）cm-1：3240（OH），1650（α，β-不饱和C=O），1600，1550，1496（苯环）。1HNMR（DMSO-d6）：δ：12.60（1H，s），10.81（1H，s），9.67（1H，s），9.10（1H，s）为四个酚羟基质子信号，其中δ12.60位5位羟基质子信号，因其与C=O形成氢键而大幅度移向低场。δ：7.65(1H，dd，J=8.4，2.4Hz)，7.51(1H，d，J=2.4Hz)，6.80(1H，d，J=8.4Hz)三组峰为苯环上的3个氢信号，判断其组成了1个ABX系统，提示分子结构中有三取代的苯环存在，是典型3＇，4＇-二氧取代黄酮类化合物B环上的2＇，6＇-H和5＇-H质子信号。δ：6.39(1H，d，J=2.1Hz)，6.19(1H，d，J=2.1Hz)峰为苯环上的2个间位偶合的氢信号，可归属于苷元A环的8-H和6-H，示A环为5,7-二氧取代。δ：5.36(1H，d，J=7.5Hz)为糖的端基质子信号，根据其偶合常数可知糖苷键为β构型。13CNMR（DMSO-d6）δ：177.8(C-4羰基),δ：156.7(C-2),133.9(C-3),为典型的黄酮醇类骨架类型。同时也可观察到糖的一组碳信号，δ：102.2为糖端基碳信号，δ：75.9，73.3，71.4，68.1，60.3是糖上其它碳信号，经与糖标准数据对照，确定为β-D-半乳糖。结合1HNMR和13CNMR数据，推断该化合物苷元为槲皮素。A的苷元部分与文献相比13CNMRδ：C-2，C-3信号分别位移了+10和-2，说明C-3位取代成苷。综合上述各种结果，鉴定A为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷即金丝桃苷(hyperosid)，其结构式见图1，全部碳氢信号归属见表1。图1化合物A结构式表1化合物A的1HNMR和13CNMR数据No.δCδHNo.δCδH2156.71′121.43133.92′115.57.51(1H，d，J=2.4Hz)4177.83′144.85161.14′148.5698.66.39(1H，d，J=2.1Hz)5′116.37.51(1H，d，J=2.4Hz)7164.26′122.17.65(1H，dd，J=8.4，2.4Hz)893.96.39(1H，d，J=2.1Hz)1″102.25.36(1H，d，J=7.5Hz)9156.62″71.410104.23″73.33.1-3.7(10H,m,糖上其余6个C5-OH12.60（1H，s）4″68.1质子和4个-OH质子)C7-OH10.81（1H，s）5″75.9C3′-OH9.67（1H，s）6″60.3C4′-OH9.10（1H，s）三、单体化合物抗流感病毒活性测定对所得部分化合物按EFY活性筛选方法进行了抗流感病毒活性测定。结果表明，所试的化合物中，大部分由于细胞毒性较大难以测定其活性，只有两个化合物显示出较好的抗流感病毒活性，且毒性较低，但两者的抗流感病毒活性均不及EFY.由此也可以看出，中药复方的药效不仅仅依赖于某一个或几个单体成分的作用，而应是整体协同作用的结果。四、银翘散抗流感病毒有效组分群质量控制研究银翘散组方中各单味药的化学成分研究表明，其主要含有黄酮类、木脂素类、三萜类、挥发油类等，从银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）化学成分的分离鉴定中也发现了大量的黄酮类和木脂素类成分。现代药理学研究表明黄酮类和木脂素类具有良好的抗流感病毒活性，我们在实验中也发现，当EFY经聚酰胺处理时，水洗部分与醇洗部分均显示抗流感病毒活性，但作用不及EFY。结合上述实验结果，可以确定在银翘散抗流感病毒有效组分群中如此高含量的黄酮类和木脂素类成分就是其抗流感病毒的有效成分。为了更好的控制EFY的质量，我们采用总成分和单体化合物共同测定作为质量控制的定量指标即采用比色法、紫外分光光度法及反相高效液相色谱法分别对EFY中的主要成分类别总黄酮和总木脂素以及主要指标性成分醉鱼草苷、异甘草素和牛蒡子苷进行定量研究。现以HPLC测定EFY中牛蒡子苷含量为例说明定量分析的一般方法。1.仪器与试药Waters515高效液相色谱泵，Waters2487DualλAbsorbance检测器，Millen-nium32ChromatographyManager化学工作站；H66025型超声清洗机.牛蒡子苷（arctiin）对照品（购自中国药品生物制品检定所）。银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）。乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。2.对照品溶液制备对照品溶液的配制精密称取牛蒡子苷对照品8.8mg，置于100ml容量瓶中，用甲醇完全溶解并稀释至刻度，配制成0.088mg/ml的对照品溶液。3.样品溶液的制备精密称取EFY样品约10.0mg，置于10ml容量瓶中，加适量50%乙腈溶液超声使其完全溶解后加50%乙腈溶液定容至刻度。经0.45μm微孔滤膜过滤，即得样品溶液。4.色谱条件色谱柱:YWG-C18柱(250mm×4.6mm,10μm)；流动相：乙睛-水系统(25:75)；流速：1.0ml/min；柱温：室温；紫外检测器：0.08AUFS，检测波长278nm。5.方法与结果5.1检测波长的选择取牛蒡子苷对照品适量，用甲醇溶解并稀释，以甲醇为空白，在200-400nm扫描，证明牛蒡子苷在278nm处有较强的吸收。因此，选定278nm为测定的紫外检测波长。牛蒡子苷甲醇液紫外光谱图见图2。图2牛蒡子苷甲醇液紫外光谱图5.2流动相的选择选用C18柱，用不同比例的乙腈-水系统为流动相，发现乙睛-水系统在(25:75)时分离效果较好，其保留时间适中，分离度亦符合要求。因此选定乙睛-水(25:75)为流动相。样品与对照品HPLC色谱图见图3。图3牛蒡子苷对照品（Ⅰ）、样品EFY（Ⅱ）及阴性样品（Ⅲ）HPLC色谱图1牛蒡子苷5.3空白试验取按处方比例及工艺制得不含牛蒡子(牛蒡子苷)的阴性样品，按“样品溶液的制备”项下配制阴性样品溶液，进样10μl，记录色谱图，结果见图3。表明处方中的其它成分不干扰牛蒡子苷的测定。5.4系统适用性试验根据色谱图1-I计算，可得牛蒡子苷的理论塔板数(N)为5381；拖尾因子(T)为1.02。根据色谱图1-Ⅱ计算，牛蒡子苷与其它成分分离良好即分离度R>1.5。5.5线性考察精密吸取对照品溶液2.5，5.0，7.5，10.0，12.5μl，按上述色谱条件进样，测定峰面积值。以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算牛蒡子苷回归方程为Y=1.13×10-6X-9.50×10-3，r=0.9998。结果表明，牛蒡子苷在0.22-1.10μg范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系。5.6精密度考察精密吸取同一对照品溶液10μl，连续进样6次，测定牛蒡子苷色谱峰峰面积，计算峰面积RSD为0.33%，表明精密度良好。5.7稳定性考察精密吸取样品溶液10μl，分别于制备后0，2，4，6，8，10，12，24h进样，测定牛蒡子苷色谱峰峰面积，计算峰面积RSD为0.72%，表明样品溶液在24h内基本稳定。5.8重复性考察取同一批EFY样品，按样品溶液制备方法平行制备6份样品溶液，分别进样10μl，测定牛蒡子苷色谱峰峰面积，计算牛蒡子苷平均含量为40.21mg/g，RSD为1.57%，表明该方法重复性良好。5.9加样回收率实验精密称取已知含量（牛蒡子苷含量为40.21mg/g）的样品6份，每份约5mg，置于10ml容量瓶中，分别精密加入牛蒡子苷对照品溶液2.0ml(相当于0.1760mg)，按样品溶液制备方法制备样品溶液，分别进样10μl，测定牛蒡子苷色谱峰峰面积，根据计