现代组织学酶组织及免疫化学课件

现代组织学酶组织及免疫化学现代组织学酶组织及免疫化学现代组织学酶组织及免疫化学酶组织化学曾文姣复旦大学上海医学院病理系一、概述：酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质降低生化反应的反应活化能低反应条件专一性高效性103-106倍易变性失活一、注重发展学生兴趣，实现创新1.因材施教，发展学生的创新兴趣兴趣是学生最好的老师，外界的压力可能只会作用于学生一时，而兴趣则可以作为一股持久的力量激励学生更好地进行学习。因此，在教学中，教师要积极调动学生学习的欲望。此外，还要注重学生发散思维的增强，在不断的想象中促进学生创新意识的塑造。允许学生在知识界定的范围内犯错误，改正错误，在此基础上培养学生发现问题、正视问题、改正问题的能力，达到教学相长的目的。要启发学生善于思考，在思考中产生兴趣，在兴趣中产生动力，并充分认识自身学习方面的不足。还要注重引导学生将数学与其他学科相联系，发展学生的综合运用能力。2.建立独特的解题技巧，发展学习兴趣数学相对于其他学科，解题方法往往并不是唯一的，而是较为灵活的。因此，教师通过对题目的解答，可以潜移默化地改变学生的思维，启发学生运用多种解题方式，充分激发学生的创新思维，调用多方面的知识，将几个方面的知识联系在一起，既可以对以前的知识进行巩固，也可以扎实对新知识的利用。多个角度思考能够让学生更加周密地解决数学问题，改变思考方式。巧妙而精确的解题方式可以培养学生的观察能力和对问题的敏感度。内在兴趣与外在鼓励的结合，可以使学生处于源源不断的学习动力之中，使学生在熟练掌握理论之后更加注重对理论的实践，全面掌握新知识。错题的举例能够加深学生对错误的认识，举一反三。此外，要打破传统教学方式，墨守成规只会停滞不前，要鼓励学生大胆想象，勇于表达，创新求异，寻找灵活准确的解决方法。3.正确引导学生认识，树立正确观念学生在学习过程中往往对于新知识的吸收并不理想，在这种情况下要注意调整学生的心态，时刻注意学生的心理变化，多鼓励，增强学生的自信心，使学生有动力地学习，减少批评，以免学生产生对数学的厌学心理。教师是教学中的主体，教师对学生心理的敏锐洞察有利于教师准确寻找学生在学习中的不足。只会理论而不会实践，学再多都只是空话，因此，老师还要注重学生实践能力的培养，让学生有更多表现的机会。要注意课余作业的优化，减轻学生的课余负担，使学生在课余能够有更多的实践时间。二、创新意识是教师进行高效教学的关键教师如果没有正确、系统的教授方法，学生的思维模式就会一成不变。社会是处于不断变化中的，只有不断地创新才能跟上时代的步伐，创新意识是指在现有知识的基础上能够不断探索更加新颖的教学方式，勇于改变传统课堂上的严肃学习氛围，让学生自由想象，自主解决。有效的师生互动更能带动学生思考，活跃的课堂氛围是高效学习的前提。1.兴趣是最好的老师换句话说，兴趣也是学生的启蒙老师，因此，比起传统的学校教学，发掘学生的兴趣并因材施教能更好地提高学生的学习效率。初中生好奇心强，抓住这一心理变化，教师在课堂中可以从学生感兴趣的内容出发，勾起学生的好奇心，继而向所学内容靠近，从而激发学生的求知欲，这一欲望的挖掘为学生的学习提供了内外动力。除了内在因素，外在因素则为学习环境。教师是教学过程中的主导人物，他在注重培养学生思维的同时，还要重视自身的教学方式。对于学生的成绩，教师不能一味地只注重讲课和学生的成绩，而不考虑其他影响因素，要勇于挑战传统的古板严肃的课堂，只有活泼愉快的课堂气氛才能调动学生的学习情绪，在没有成绩压力和不拘谨的课堂氛围中能够让学生更加大胆地解决问题。老师可以采用学生自问自答的形式，把学生发现问题和解决问题的能力逐渐培养起来。2.激励教育，全面发展激励是最好的外在动力。如果对学生只知道批评，学生不仅会产生叛逆心理，甚至会失去学习兴趣。因此，教师要多与学生交流、沟通，及时发现学生在学习上的不足，并给予正确的引导和鼓励。教师还可以通过提问来调整学生的思维方向，形成一套完整、准确的解题思维模式。教师还要鼓励学生多提问，培养学生的质疑精神，提高学生学习的积极性。良好的习惯是成功的保证，由此看来，学习习惯至关重要，教师要教给学生系统的学习方法，传统只教授书本知识的教学方法已经赶不上时代的变迁，只有全方位地教授，才能使学生掌握有血有肉、更加全面的知识，才有利于促进学生的全面发展。在竞争日益激烈的今天，只有具备独特的思维才能更好地战胜其他竞争者。而数学就是培养出色思维的一门学科。教师要充分、高效率地利用课堂的四十五分钟，采用以上方法，促进初中课堂的创新，营造融洽、舒适的学习氛围，才能使学生更加出色地完成学习任务，才能尽一名中学教师的神圣职责。苏霍姆林斯基说：“在人的心理深处，都有一种需要，这就是希望自己是一个发现者、研究者、探索者。”新课程改革的一个重要目标就是转变学生的学习方式，它要求学生由原来的“接受式学习”转变为“探究式学习”，以此激发学生的学习兴趣和学习动机。“探究式学习”总是围绕具体问题展开的，这就要求学生具备较强的问题意识，能够发现、提出有价值的问题。在历史教学中有意识地创设问题情境，可以激发学生的学习兴趣和学习动机，让学生真正成为发现者、研究者、探索者。一、创设问题情境在历史教学中的意义在教学中创设问题情境以培养学生的学习兴趣为前提，诱发学生学习的主动性；以观察、感受为基础，强化学生学习的探究性；以发展学生的思维为中心，着眼于培养学生的创造性；以陶冶学生的情感为动因，渗透教育性；以解决问题为手段，贯穿实践性。通过问题情境的创设，可以把复杂的事情简单化，把抽象的事情形象化，把枯燥的事情趣味化，把理性的事情感性化，从而激发学生的兴趣，开发学生的潜能，发展多元化智能。教师在教学中有意识地创设问题情境，让学生主动参与，借助解决问题来启动思维，使学生变被动接受知识为主动获取知识，从而实现自主探索性学习。从教学的效果看，运用问题情境教学的核心作用在于以情境激活课堂，以问题引领思维，达到提高课堂效率的目的。二、历史教学中问题情境创设的常用途径1.创设虚拟角色，设置问题情境美国学者克拉克和斯塔尔在《中学教学法》一书中对角色扮演下的定义是：“角色扮演是通过某个场面中参加者的角色扮演使表演人和观众了解这一场面的未经排练的戏剧表现。”社会生活中的许多活动，学生都没有亲身经历的经验，学习时也就难以产生情感共鸣，为此创设一些如演员般的角色，让学生通过形体语言、角色扮演、情境体验来感悟教育目标，是一种有极大说服力的教学手段。例如教学《卓尔不群的雅典》时，可以虚拟“雅典人帕帕迪的政治生活”情景一：帕帕迪是个雅典郊区的农民，今年（前399年）三十岁，他是家庭中的男主人。今天是个太阳高照的日子，他要去雅典去参加公民大会，他妻子也跟着去。设问1.这个公民大会虽然每十天就开一次，严重影响帕帕迪干农活，但他还是很愿意去，为什么？情景二：两人到了公民大会会场门口，执勤的监察员却阻止帕帕迪的妻子进入会场。设问2.这是为什么？还有什么人如果想来也会被阻止？情景三：公民大会结束后，帕帕迪有资格参与法庭审判员的抽签。通过抽签他很幸运地成为五百人会议中的一员。设问3.不识字的帕帕迪为什么能担任公职？通过这一系列设计，让学生穿越时光的隧道，置身于历史环境中，体验历史人物的内心世界，将一些抽象的历史知识、深奥的道理以具体的形象作深入浅出的说明。2.创设歌谣式问题情境歌谣可以把历史生活化，而生活化的问题情境适合学生思维形象具体的特点，易于引导学生的兴趣，愉悦学生的情结，集中学生的学习注意力，从而激发学生学习的积极性和主动性。例如，教学《君主专制政体的演进与强化》时，可以以歌谣导入：好了歌人人说做皇帝好，其实皇帝也苦恼。忠奸难辨睡不好，后宫争宠吃不消。要是官吏选不好，贪污腐败治不了。最怕地方造反了，身家性命也难保。这首歌谣把皇帝的“烦恼”一下子拉到了现实生活中，让学生直观感悟到皇帝的“烦恼”，从而引导学生思考：皇帝的“烦恼”有哪些？为什么会产生这些烦恼？该怎么解决？激发学生积极、主动地为皇帝的“烦恼”找病因、开处方。3.创设大事年表式问题情境通过创设大事年表式情境可以提供富有历史细节的、大事年表式的材料，可以营造亲历历史的现场气氛，让历史变得鲜活，还可以帮助学生理解历史事件之间的联系。所以大事年表式问题情境的创设，能激发学生的学习兴趣，开启学生的思路，丰富想象加强记忆，有利于学生愉快的氛围中获取新知，发展智力。如教学《俄国十月社会主义革命》时，可以这样设置情境：1917年俄国二月革命3月8日，9万群众集会涅瓦大街；3月9日，20万群众集会涅瓦大街；3月10日，彼得格勒工人总罢工；3月11日晚，600名士兵起义；3月12日晨，10200名士兵起义；3月12日午，25700名士兵起义；3月12日晚，66700名士兵起义。8天后……1917年3月15日3月15日午夜，沙皇签署退位宣言。罗曼诺夫王朝崩溃！俄国沙皇体制终结！3月15日，在工兵代表苏维埃的支持下，资产阶级临时政府成立――两个政权并存。问题一：370年的沙皇体制何以如此脆弱地在8天之内就会土崩瓦解呢？8个月后……1917年11月7日临时政府被推翻，布尔什维克掌权问题二：这个被人们寄予厚望的新生临时政府，何以会在一夜之间匆匆而去呢？那个并没有太大影响的布尔什维克党，何以又在一夜之间匆匆而来呢？综上所述，现在新课程的目标就在于学生学习方式的变革，即学生由被动接受式学习向主动探究式学习转变，而这种转变就是建立在学生对历史问题探究解决的过程中，历史问题情境的创设无疑是学生主动探究学习的前提与关键，是学生思维创新的源泉。采用多种方式精心设计问题情境，调动学生学习的积极性，引起学生情感上的共鸣，为学生营造一个宽松、愉悦、积极向上的课堂氛围，鼓励学生积极思维，开展有益的讨论，引导学生用眼观察，激发学生动脑思考，启发学生动口讨论，组织学生动手操作，体现了学生是学习的主人，把课堂交给了学生，引发了学生的学习兴趣，从而达到提高教学效率的目的。

酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂解酶5.异构酶6.合成酶目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种二、酶组织化学反应的基本知识（一）酶的特性水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强（二）酶的定位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位

浆膜细胞膜线粒体

……(三）酶组化的基本条件同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂酶组织化学的原理

细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物，即初反应物(primaryreactionproduct,PRP)。 然后其中之一再与辅助试剂经一步或二步反应生成有色不溶水的终反应物(finalreactionproduct,FRP)沉积在原位以显示酶的存在和活性大小。（四）原理及一般原则GGTG6PArtifact-弥散受三个因素影响：

底物在酶催化下水解的速度—快则弥散轻

PRP在缓冲液中的弥散系数—小则弥散轻

PRP与辅助试剂反应的速度—快则弥散轻2.酶组织化学的一般原则:*组织处理及制片不能影响酶活性和分布*底物和辅助试剂渗透好*底物对酶要有特异性*辅助试剂不能影响酶活性和其它反应剂的渗透*PRP与辅助试剂反应要快，FRP必需是水不溶、有色且稳定的物质*所有试剂不能与组织细胞有非特异性的吸附3.酶组织化学的组织处理：绝大多数需冰冻切片（氯乙酸酯酶可用低温石蜡切片）速冻长期保存要密封，-70℃

不固定预固定低浓度（1-4%）多聚甲醛福尔马林戊二醛细胞涂片、培养细胞干燥、密封、低温三、酶显示方法

同步显示法二步显示法（孵育后偶联法）底物自身显示法

常用酶显示反应（1）金属离子沉淀反应*利用铅盐与硫化铵生成棕黑色沉淀（PbS)显示酶活性及定位

*二步显示法

Gomori’sReaction酶促反应(酸性磷酸酶）CH2-OHCH2-OHONaCH-O-P=OCH2-OH+Pb3(PO4)2ONa酶CH2-OHCH2-OH显色反应Pb3(PO4)2+3S2-3PbS（棕黑色沉淀）酸性磷酸酶、ATP酶、5′-核苷酸酶H2O+Pb2（2）偶氮盐偶联反应（同步显示法）碱性磷酸酶a-萘基磷酸钠磷酸氢二钠+a-萘酚-萘酚+FastBlue偶氮染料（蓝色沉淀）酯酶、转肽酶、肽酶酶+水（3）靛蓝反应底物被酶分解为二个PRP，其中之一可在一定条件下形成不溶的靛蓝酯酶吲哚酚酯吲哚酚+RCOOH2吲哚酚靛蓝胆硷酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异酯酶酶+水氧化（4）四唑反应双四唑盐（深蓝沉淀，不溶于脂肪）

H+H+

（NBT）底物四唑盐

单四唑盐（蓝色细颗粒，溶于脂肪）

（MTT）氧化酶脱氢酶（5）底物自身显示法过氧化物酶（联苯胺法）

NH2NH2酶

+H2O2NHNH棕色沉淀2H四、酶组织化学的应用（1）观察组织细胞代谢心肌梗死2小时琥珀酸脱氢酶细胞色素氧化酶HE无改变异柠檬酸脱氢酶磷酸化酶Reys’sSyndrome多见于儿童，急性致死性脑病、脂肪肝、肝功能衰竭，高血氨肝细胞琥珀酸脱氢酶活性下降（2）细胞类型及细胞定位氯乙酸酯酶→中性粒细胞（被抗CD66C,CD66D,CD88抗体的免疫组化代替）非特异性酯酶→Mf（被抗CD64、CD68抗体的免疫组化代替）乙酰胆硷酯酶→小肠神经节细胞ATP酶→皮肤郎罕氏细胞（3）癌前病变的标志以肝癌发生为例肝细胞癌增生结节GGTAFPG6P小肝细胞持续存在或消退？胆管样细胞过渡细胞卵圆细胞肝细胞（4）免疫组化和杂交组化的显示方法与酶组化的不同，在于是检测引入酶免疫组化常用HRP（DAB+H2O2）杂交组化常用AP（NBT+BCIP）Thankyou免疫化学ImmuneChemistryinImmunohistochemistryThreeaspects:*抗原提取和纯化*抗体制备和纯化*抗体标记1.抗原提取和纯化目的：制备特异性抗体多克隆、单克隆抗原：能在机体引起体液免疫和细胞免疫的物质

免疫原性：抗原能激发机体产生抗体或致敏淋巴细胞免疫反应性：抗原能与抗体或致敏淋巴细胞发生结合及反应全抗原及半抗原全抗原：既有免疫原性又有免疫反应性半抗原：有免疫反应性无免疫原性半抗原改造：与大分子载体结合，变成全抗原

小肽（半抗原）+白蛋白全抗原戊二醛（-NH2）碳化二亚胺（-COOH）抗原分类：结构抗原cytoskeleton

分泌抗原cytokineshormones

沉积抗原ImmuneComplex

入侵抗原virusbacteriaparasite抗原提纯的一般原则*抗原检测方法的选择和建立特异性：Ab-AgLigand-ReceptorSubstrate-Enzyme

非特异性：MWIsoelectricPoint(IP)Determinedbyelectrophoresis*选择材料含量高、经济、易得

Dm←鸡肫（gizzard)Vm←牛晶状体（cowlens)*保持抗原分子的稳定（1）pH：选择pH适当的Buffer

（2）温度：0-4℃（除冷敏感的抗原）（3）-SH基的保护：2-巯基乙醇半胱氨酸还原型谷胱苷肽（4）去重金属离子：pbFeCuetc.0.001-0.003MEDTA（乙二胺四乙酸）

EGTA（乙二醇双乙胺醚NN′-四乙酸）（5）疏水与亲水环境：疏水甘油、蔗糖、DMSO（二甲基亚砜）亲水KClNaClNH4Cl等（6）防降解（蛋白）：Proteolyticartifactsarepervasive,perplexing,persistentandperniciousbutwithproperprecautions,preventable--Pringle—蛋白水解酶：内肽酶外肽酶抑制剂可逆pepstatin(抑门冬氨酸蛋白酶）不可逆DIPF（二异丙基氟磷酸）

PMSF（苯甲基磺酰氟）（抑丝氨酸蛋白酶）*步骤和方法步骤：（1）增溶溶解目的：a.将蛋白抗原从细胞组织中抽提出溶于水溶液；

b.抗原为不溶性的，可洗去大量可溶蛋白，达到初步纯化促溶：离子性去污剂–SDS

非离子性去污剂–TritonX-100等

常用方法：

a.渗透溶胞低渗细胞膜破裂高渗激活水解酶→自溶→释放膜Agb.研磨研钵匀浆器

c.绞切组织绞切器高速、产热

d.超声波物理效应（空化作用）使膜解聚，非共价键断裂，产热

e.挤压用高压（4000-8000磅）使细胞通过微孔（2）分离纯化（以蛋白或多肽抗原为例）原则：先粗后细、先简后繁小样本、预实验、最优化

a.差别溶解法利用欲提取的蛋白抗原在一定条件下与细胞其它蛋白溶解度的差异来进行初步分离。常用盐析法以中性盐为常用，中性盐中又以硫酸铵最为常用

使用硫酸铵时，注意点：

※硫酸铵需纯化

150克硫酸铵溶于0.01MEDTA(双蒸水配）→过滤去杂→加入

150ml无水乙醇→出现硫酸铵沉淀→过滤取沉淀，烘干备用

※氨水调pH至7.4或需要的pH值

※蛋白质浓度要适当，防共沉

※及时去盐，用透析法

其它有机溶剂、等电点沉淀、PEG

低分子PEG（PEG400）沉淀法分离的精度很高，有时可与凝胶层析比美b.层析法离子交换阴离子交换剂（DEAE纤维素）吸附pH7-9

阳离子交换剂（CM纤维素）吸附pH4.5-6

选择性吸附羟基磷灰石吸附中性、酸性蛋白排除硷性蛋白分子筛Sephadex及新的升级换代产品亲和层析S-EAb-Ag效率高

电泳法分离效果好、简便、周期短

被分离的蛋白电泳带与其它成分的电泳带分得较开一次获得的纯化样品较少（3）抗原纯度鉴定取决于方法灵敏度与分辩率

PAGE,等电点聚焦电泳只显示固有条带时，认为是电泳纯

免疫电泳

免疫纯抗原合成方法人工合成多肽（全成肽）细菌超表达克隆化基因附：基因工程方法制备抗原Telomeres(端粒）染色体末端DNA重复序列串联人的重复序列串联为TTAGGGhTRT(humanTelomericReverseTranscriptase)在肿瘤中活性很高

1T-motifhTRT6RT-motif技术路线：K562→总RNA→RT-PCR→1.2KbDNA片段→克隆至pGEM-TEasyvector→扩增、测序→亚克隆至PinPointXa-1vector→大肠杆菌表达→亲和层析纯化→融合蛋白（含目的多肽）→单抗2.抗体制备

单克隆、多克隆抗体抗原决定簇（antigenicdeterminant)

抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团又称表位(epitope)单克隆抗体只针对某一特定的抗原决定簇，常采用杂交瘤技术制备多克隆抗体针对多个抗原决定簇的抗体，实际上是多个单克隆抗体的混合物McAbMcAbMcAbPcAb多克隆与单克隆抗体的比较多克隆抗体单克隆抗体分子结构不均一均一与抗原决定簇反应多价单价特异性取决于抗体强亲合力有强有弱取决于抗体免疫组化染色较强取决于抗体但背景清琼脂双扩散可见沉淀线取决于抗体ELISA取决于抗体结果较好免疫印迹结果好取决于抗体*将多株单克隆抗体混合使用效果更胜一筹（1）多克隆抗体制备a.动物提供抗原的动物种系与产生抗体的动物种系相差越远越好选取何种动物取决于：饲养条件抗原量所需抗血清量小鼠、兔（新西兰家兔）、羊、马、猪等b.佐剂(Adjuvant)增强免疫，提高抗体效价常用福氏佐剂（85%石蜡油+15%羊毛脂）加卡介苗（2mg/ml佐剂）则为完全福氏佐剂(FCA)首次用1/2体积FCA+1/2体积抗原溶液二次或三次加强时用不完全福氏佐剂或不用佐剂乳化c.半抗原的处理半抗原与载体结合d.方法#途径i.m.,i.v.,i.d.,i.p.,s.c.

大动物不用腹腔注射颗粒抗原及含佐剂的不能i.v.

效果较好的是i.d.Multiplesites>mono-sitesRabbit背部皮内10点以上，0.1-0.2ml/点总量约50mg-200mg

淋巴结内注射上医学报：1986，13（1）：69-71将纯化的AFP进行淋巴结内注射新西兰家兔足垫先注射少量完全福氏佐剂，10天后见腘窝淋巴结肿大用微量AFP（25mg）注射入肿大淋巴结共三次，取耳血测效价#次数与间隔时间2-3次数或更多首次10-15天再加强注射，剂量同首次或1/2量，用不全佐剂或不用佐剂加强注射间隔时间动物大，时间最好长些豚鼠、大鼠7-8天兔10-15天羊14-28天#效价测定环状沉淀试验需较多抗血清琼脂免疫双扩散McAb?小分子半抗原？对流免疫电泳

ELISA

免疫组织化学#放血或定期抽血兔、羊；豚鼠、大鼠；小鼠；鸡；离心取抗血清，加0.01-0.02%NaN3分装保存#抗体纯度鉴定免疫电泳（2）单克隆抗体制备70年代初有人想在体外延长Ab分泌细胞的寿命1975年Kohler&Milstien发明了杂交瘤技术六步骤：a.免疫动物BALB/c小鼠i.p.

可溶蛋白抗原1mg-200mg/injection

总量最好不超过500mg

细胞106

为增强Mj的反应，将抗原结在琼脂糖珠或

PAG珠或硝酸纤维膜上，进行免疫一般免疫3-4次，血中效价最高的小鼠脾用于细胞融合，用前3天常用i.v.冲击一次，以进一步提高效价。b.细胞融合骨髓瘤细胞株（SP2/0）培养密度2X105/ml，融合所需细胞2X107小鼠脾含5X107～2X108淋巴细胞SP2/0︰脾细胞=1︰8，range:1︰4～1︰12融合剂：PEG（1000-3000），常用1500，50%W/V融合操作时需非常温和地边搅拌边加PEG，c.选择培养SP2/0(HGPRT–,Ig–,TK–)pre-plasmacell(HGPRT+,Ig+,TK+)immortal+immortal–DeNovopathway+DeNovopathway+salvagepathway–salvagepathway+fusionHybridomasalvagepathway+immortal+Ig+HATHATHATNon-viableNon-viableviableNotice:支原体污染会影响杂交瘤生长∵

thymidinethymine在培液中加一定量的抗支原体化学药可预防支原体污染效果肯定的是Bayer公司生产的CiprofloxacinHydrochloride支原体d.阳性克隆筛选检测抗体目的是筛选分泌所需抗体的单克隆杂交瘤细胞株常用：ELISA

放免法免疫组化敏感度相对较低，但可靠关键是组织中目的抗原保存必须良好建议用冰冻切片或低温石蜡切片

ABC或二步法敏感，但不是所有抗体都能用于IHCe.克隆化常用方法：软琼脂培养显微操作法有限稀释法需多次操作

(所有孔中都产生同一种抗体)f.扩大培养体外：可大量生产，培养上清中McAb含量不高，仅5-40mg/ml，污染！体内：用石蜡油或Pristane注入小鼠腹腔，剌激腹水产生，一周后接种2X107杂交瘤细胞形成腹水瘤优点：McAb浓度高，高达10mg/ml

可反复抽取腹水不易污染缺点：不能大批生产，动物死亡！（3）抗体的纯化必要性：抗体存在于抗血清或腹水或培液中，成份多而杂，使用抗体时应去除杂蛋白，以免受到干扰

#抗体在抗血清或腹水中能较长时间保持其效价！如想长期保存，应顺其自然，不要纯化

#纯化的方法不同，所获抗体的纯度不一中性盐盐析法→g-球蛋白离子交换层析法（DEAE-52）SPA或链球菌G蛋白亲和层析法抗原亲和层析柱免疫沉淀IgG酶解IgG特异性IgGPapain2Fab+FcPepsin→F(ab′)2+Fc片段技术进展兔类单克隆抗体1995年KatherineKnight利用转基因方法获得了稳定的兔骨髓瘤样细胞株（240E细胞）。人源化抗体鼠源抗体的人源化改造噬菌体抗体库技术转基因鼠技术基因工程制备抗肿瘤单抗单链可变区(singlechainFragmentvariable,scFv)高变区（抗原结合位点和独特型）合适的连接肽链scFvscFv的特点：#保留与抗原的结合位点#分子小，能有效穿透肿瘤微循环而接触肿瘤#大大降低免疫原性#该片段不用二硫键连接，可在原核细胞表达对连接肽链的要求：#使重、轻链可变区之间保持适当的距离#其肽键角与重、轻链肽键角的角度要相适应#不影响重、轻链可变区肽链结构的形成技术路线a.筛选产生人源性抗肿瘤的单克隆B细胞株

新鲜胃癌切除标本ELISA测能否分泌抗体↓（约转化后10-14天）酶消化法得到细胞悬液↓↓测能否分泌抗胃癌抗体完全培液培养过夜，使肿瘤细胞贴壁胃癌患者外周血（胃癌细胞ELISA，IHC）↓↓↓

Ficoll-hypague梯度离心获得单个核细胞有限稀释法克隆↓↓绵羊红细胞玫瑰花结实验去除T细胞获分泌抗胃癌抗体的单克隆B细胞株↓获得B淋巴细胞↓用EB病毒使B细胞永生化↓

b.基因工程抗胃癌单克隆抗体单链可变区提取单克隆B细胞株总RNA↓

分别获得抗胃癌单抗重、轻链可变区的基因序列（RT-PCR方法）↓用短肽链基因序列将两者连接成目的scFv基因↓将scFv基因构建入原核表达质粒PET-vector↓

转化大肠杆菌，表达scFv蛋白

3.

抗体标记标记物有五大类：

荧光素、酶、胶体金、铁蛋白、其它荧光素-FITC标记酶标记-HRP标记（1）荧光素标记常用荧光素：异硫氢酸荧光素（FITC）

Rhodamine类

TexasredFITC在紫外线激发下发出翠绿色荧光标记原理

HS蛋白-N+C=N-FITC蛋白-NH-C-NH-FITCHMarshall法：高浓度免疫IgG+FITC冷浴避光4℃过夜(30-40mg/ml)(0.02mg/mgP)搅拌6h

过SephadexG-25orG-50去逰离FITC分子4℃保存备用或加0.2%NaN3及2%牛血清白蛋白后分装保存于-20℃（2）酶（HRP）标记

常用酶不下十种，包括HRP、GO、AP、G6PDH、

b-半乳糖苷酶、乙酰胆硷酯酶、苹果酸脱氢酶、溶菌酶、葡萄糖淀粉酶等。HRP的RZ值>3.0传统方法：戊二醛法利用戊二醛二个醛基与酶和IgG的逰离氨基发生反应而标记(HRP逰离氨基少，故标记率不很高！）

一步法：HRP+IgG+GA(IgG-NH2多于HRP！）二步法：HRP+过量GA→HRP-GA，去GAHRP-GA+IgG→HRP-GA-IgG

过碘酸钠法HRP-糖基-OHHRP-糖基-CHO+NH2-IgGHRP-糖基-C=N-IgGH#标记效率