分子诊断技术的临床应用详解演示文稿

分子诊断技术的临床应用详解演示文稿当前第1页\共有28页\编于星期日\19点（优选）分子诊断技术的临床应用当前第2页\共有28页\编于星期日\19点根据分子诊断技术特征划分为三类：一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交。分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交到聚合酶链反应（PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。当前第3页\共有28页\编于星期日\19点二、基于测序技术为基础的分子诊断技术DNA的序列分析是分子诊断学的金标准，各种遗传疾病，病毒或细菌的感染与变异，在基因表达水平上的个性化用药，多基因疾病的诊断与预测，最终都可以借助基因测序平台的应用。当前第4页\共有28页\编于星期日\19点三、基于扩增技术为基础的分子诊断技术1983年Mullis发明了聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR），使体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操作DNA或RNA技术的发展。到现在，扩增DNA的技术已经成为分子诊断应用最广的技术之一，并发展变化了数十种核酸扩增检测技术。当前第5页\共有28页\编于星期日\19点二、PCR概述（一）PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项体外核酸扩增技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。当前第6页\共有28页\编于星期日\19点

PCR技术能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。二、PCR概述当前第7页\共有28页\编于星期日\19点九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR发展简史1983

Mullis于12月16日成功发明了PCR1985关于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》杂志上发表198912月《Science》杂志将PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。199310月13日Mullis获诺贝尔化学奖

1995荧光定量PCR技术出现当前第8页\共有28页\编于星期日\19点PCR技术PCR核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化，使应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。当前第9页\共有28页\编于星期日\19点PCR概述——2000至2013年发表论文1280748篇当前第10页\共有28页\编于星期日\19点二、PCR概述（二）原理双链DNA变性

退火

延伸

（膜板）

（双链分成单链）

（膜板与引物杂交）

（DNA合成）不断重复PCR循环次数与DNA产量关系当前第11页\共有28页\编于星期日\19点高灵敏度高特异性简便快捷高效扩增、忠实复制！PCR反应的特点当前第12页\共有28页\编于星期日\19点三、荧光定量PCR技术的临床应用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因检测优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒（RUB）其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等一病原体检测当前第13页\共有28页\编于星期日\19点常规结核病实验室诊断方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：阳性率低、费时2.细胞培养“金标准”：周期太长(4-8W)3.血清学诊断：

a.接种BCG可出现阳性

b.不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人

c.交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！当前第14页\共有28页\编于星期日\19点荧光定量PCR检测TB-DNA的意义1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核血液——播散性结核和各脏器的结核病脑脊液——中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病当前第15页\共有28页\编于星期日\19点3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。

4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据荧光定量PCR检测TB-DNA的意义当前第16页\共有28页\编于星期日\19点二肿瘤相关基因表达的检测：1、包括癌基因、抗癌基因2、肿瘤转移基因3、转移抑制基因三、荧光定量PCR技术的临床应用当前第17页\共有28页\编于星期日\19点三遗传病1、等位基因检测2、多基因遗传病的突变检测3、基因表达异常所致遗传病检测三、荧光定量PCR技术的临床应用当前第18页\共有28页\编于星期日\19点四其它应用1.法医学鉴定2.抗病毒药物疗效的观察、指导3.缩短诊断的窗口期三、荧光定量PCR技术的临床应用当前第19页\共有28页\编于星期日\19点窗口期：所谓“窗口期”,是指从感染病原体开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。美国90％以上输血传播HIV和HBV以及75％以上输血HCV的危险性均来自“窗口期”感染献血。当前第20页\共有28页\编于星期日\19点

提供直接证据缩短“窗口期”PCR检测的临床意义项目ELISA窗口期项目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10当前第21页\共有28页\编于星期日\19点RNA+Ab-P24+Ab-血清阳转后的方法RNAp24Ab血清阳转抗体检测临界值

特异性抗体比例时间反应指标感染

血清阳转前的方法怎样检测HIV早期感染?当前第22页\共有28页\编于星期日\19点

婴幼儿感染HIV诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测当前第23页\共有28页\编于星期日\19点四、PCR检测的标本采集要求

项目标本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜），前列腺液、精液。女性：阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性无菌带盖的试管。NGUUTPHPVHSV当前第24页\共有28页\编于星期日\19点项目标本采集HBV无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或体液标本。2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。其他体液标本或咽拭子。也可取抗凝血标本,但一般不推荐。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。2.其他组织标本：留于无菌试管。3.也可取抗凝血标本,但需分离单个核细胞检测，阳性率才会高。（于发热时抽取）MP

咽拭子当前第25页\共有28页\编于星期日\19点五、NAT（核酸检测）技术类型：当前第26页\共有28页\编于星期日\19点实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。国内公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研发，拥有一整套自主知识产权和核心技术。当前第27页\共有28页\编于星期日\19点（SAT）技术