高二生物血红蛋白的提取和分离

高二生物血红蛋白的提取和分离第一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二课标领航1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。【重点】凝胶色谱法、电泳法基本原理。【难点】实验操作的过程及分析。第二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二课题背景为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混合在一起。要获得纯净的丙种球蛋白制品，就必须进行提取和分离。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种分子的分离。第三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二基础自主梳理一、凝胶色谱法1．依据2．概念3．原理★4．结合P64下面和P65上面，画出分离方法的表格★5．注意事项二、缓冲溶液1．作用2．配制3．意义三、电泳1．概念2．原理3．作用过程4．方法第四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二核心要点突破要点一解读实验原理1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式垂直向下运动无规则的扩散运动运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先从凝胶柱中洗脱出来后从凝柱中洗脱出来第五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二要点二第七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二四、实验操作原则：依据每一种蛋白质的来源和性质血液、红细胞、血红蛋白的组成1．样品处理：

(1)红细胞的洗涤--------离心去除血清(2)血红蛋白的释放--------蒸馏水涨破(3)分离血红蛋白溶液--------离心处理第八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二思考感悟

1．洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水？【提示】生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。第九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二思考感悟

2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？【提示】

(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。(2)甲苯的作用主要是溶解细胞膜。细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。第十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二2．粗分离：即透析(1)方法

(2)目的：将样品中相对分子质量较小的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。第十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。第十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二特别提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。第十四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶)①固定：将色谱柱垂直固定在支架上

②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内

③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h注意事项:不能有气泡存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。第十五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二(3)样品的加入和洗脱①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与________平齐，关闭出口。b．加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内.②洗脱：加入____________，打开下端出口，进行洗脱。凝胶面磷酸缓冲液第十六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二特别提醒(1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。(2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。第十七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第十八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二4．纯度鉴定：判断纯化的蛋白质是否达到要求。在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。五、操作提示1．红细胞的洗涤2．色谱柱填料的处理3．凝胶色谱柱的装填4．蛋白质的分离六、结果分析与评价第十九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二【探规寻律】对分离效果的判断(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。(2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。第二十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二【互动探究】

(1)凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项？(2)血红蛋白溶液是如何分离的？【提示】

(1)①装填前为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。②装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。③装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。第二十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二(2)蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。第二十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二 (2011年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是(

)A．它们都是分离蛋白质的重要方法B．它们的原理相同C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D．以上说法都正确【尝试解答】

__A__例1第二十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二【解析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。【误区警示】不同的蛋白质在凝胶色谱中有三种运动情况：(1)分子很小，可进入凝胶全部内孔隙；(2)分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；(3)分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分。第二十四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二跟踪训练下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质的分离度的是(

)A．层析柱