第三章-微载体培养技术-课件

一、何谓微载体？指直径60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。第三章微载体培养技术

（microcarrierculturetechnique）

1ppt课件最初采用在培养液中加入一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。如何增加细胞生长的贴壁面积？微载体系统2ppt课件1967年被用于动物细胞大规模培养。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。微载体培养系统培养4h，微载体间的细胞“桥联”×200

电镜下串在一起的肝细胞微载体×730由于肝细胞的粘附作用微载体形成“串珠”×400

脊髓灰质炎、狂犬和乙脑等疫苗3ppt课件二、微载体的商品类型第一种微载体：

VanWezel用DEAE-SephadexA50研制而来市售（国际）种类有十几种以上：液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline4ppt课件显微镜下的高密度微载体5ppt课件优良的微载体应具有的特性价廉，能重复使用。不含能毒害细胞的成分；微载体须与细胞有良好的相容性；密度应略大于培养基；粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm；良好的光学透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌；应是非刚性材料；不吸收培养基中的营养成分；收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化；6ppt课件三、微载体培养原理与操作

1、原理：将对细胞无害的颗粒——微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。丝网微载体通气的培养基鼓泡器搅拌叶轮微载体培养装置图7ppt课件●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。

●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。8ppt课件细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层；贴壁依赖性细胞在微载体表面上：贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静电引力和范德华力；9ppt课件Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化10ppt课件通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。2、搅拌转速：动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。11ppt课件搅拌速率越大，制得的微球越小，聚合物浓度越大，制得的微球较大以聚己内酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（PGLA）为基质制备可生物降解微载体12ppt课件3、细胞与微载体的相融性：与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。13ppt课件(a)MCC细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(b)MCC细胞，用纤粘连蛋白处理后的Cytodex-3表面(c)Vero细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(d)Vero细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3表面(e)Vero细胞，用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3表面细胞（Vero和MCC）在不同外源基质处理的（Cytodex-3）微载体上贴附14ppt课件

4、细胞在微载体表面的生长的影响因素

细胞方面：细胞群体、状态和类型。微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。

15ppt课件微载体系统培养细胞的步骤：(1)选择合适的微载体类型(2)浸泡水化及消毒(3)接种(4)培养观察与细胞记数(5)消化(6)分离细胞(7)传代培养16ppt课件交联葡聚糖为基质微载体纤维素为基质微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体:蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合）高分子材料为基质微载体无机玻璃基质微载体

微载体基质17ppt课件PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞，PGLA微球表面光滑不同种类聚酯的微球表面形貌差异18ppt课件多孔载体培养优点:降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质；多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养；多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。19ppt课件多孔载体制备的材料选择(1)生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用；(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。(3)热稳定性：在121℃、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。主要考虑生物相容性、机械稳定性和热稳定性20ppt课件5、微载体培养操作要点

●培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，接种细胞（对数生长期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度不同，常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。

21ppt课件贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。22ppt课件●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检；随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率；经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。

23ppt课件

●收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。24ppt课件●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。25ppt课件细胞形态饱满、生长良好细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量微载体上细胞几乎长满微载体上细胞基本长满，细胞形态健康微载体上细胞更加致密，细胞密度达到5×106个/ml以上微载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象

Marc145细胞微载体培养第1天

Marc145细胞微载体培养第2天

Marc145细胞微载体培养第3天

Marc145细胞微载体培养第4天

Marc145细胞微载体培养第10天26ppt课件四、微载体培养优点

●培养系统占地面积和空间小。

●表面积/体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；

●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；●培养基利用率较高；

●放大容易；

●细胞收获过程不复杂；

●劳动强度小；

27ppt课件传统方法——疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。BaxterBiomedical研究中心，奥地利如今——大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗成为可能驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养基内生长。中试生产中最终的生物反应器规模是1200升。包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大到生产体积为6000升。关于H1N1疫苗生产28ppt课件流感疫苗生产的大规模生产区域(A)细胞培养(B)离心分离(C)超滤、洗滤。29ppt课件Vero细胞流感疫苗生产图(A)未感染的细胞(B)早期细胞病变影响(C)收获前的晚期细胞病变大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片30ppt课件本章讲授到此，谢谢！31ppt课件何谓微载体？指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。原理：

将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。回想一下：32ppt课件

一、微囊法（microencapsulation）:

用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。第四章动物细胞的微囊化培养33ppt课件图4－1微胶囊示意图微胶囊膜生物大分子代谢产物细胞营养物质34ppt课件二、研究发展历程1、首次报道生物活性物质的微囊化研究（1957）：

将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包封在选择性透过膜中，形成球状微胶囊,称之为“生物微胶囊”。通过微胶囊膜的选择透过作用,使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进入,而生物环境中的营养成分和囊内生物活性物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微胶囊,从而达到免疫隔离目的。35ppt课件2、“人工细胞”——“人工胰腺”80年代初,Lim等人将微囊化技术与组织细胞移植相结合,制备了海藻酸钠/聚赖氨酸(APA)微胶囊,包埋猪胰岛细胞形成“人工细胞”,并移植入糖尿病大鼠体内,结果成功地调节了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被称为“人工胰腺”。该成果较好地解决了组织细胞移植过程的免疫排斥问题,避免或减少了昂贵的免疫抑制剂的使用,为组织细胞移植治疗神经/内分泌系统疾病提供了新思路。36ppt课件3、90年代以来,医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具,利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病。微囊化人胰岛培养15d微囊化小牛肾上腺嗜铬细胞培养10d微囊化肝癌细胞培养40d37ppt课件4、目前，微胶囊的应用研究涉及药物控制释放、动植物细胞培养、细胞和酶的固定化以及生化物质分离等领域,已经成为材料、化学、化工、生物和医学等多学科领域工作者的研究热点。

SEM下微胶囊的显微形貌×200LSCM下微胶囊表面形貌的照片38ppt课件不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM照片不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的SEM照片39ppt课件三、性质：曾是酶固定化技术中的一种（半透膜将酶包裹在球状的微囊里，酶及大分子不能从微囊里透出，而小分子物质可自由通过膜）。动物细胞微囊化后，与游离细胞相比，降低了培养时对细胞的剪切力，同时也能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。动物细胞微囊化培养的成功为干扰素、乙肝表面抗原(HBsAg)、单克隆抗体(MAb)等的产生提供了广泛应用前景。

40ppt课件表4－1微胶囊制备材料

来源类型材料天然脂质卵磷脂、神经鞘髓磷脂等多糖海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、淀粉等蛋白质明胶、白蛋白、纤维蛋白半合成纤维素类衍生物羧甲基纤维素钠、已基纤维素、醋酸纤维素及其酯等合成可降解型乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚内酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等41ppt课件制备方法化学法界面聚合法、乳化法、辐射化学法物理化学法相分离法、溶剂蒸发法、界面沉积法、喷雾干燥法物理法静电沉积法、气相沉积法、流化床喷雾包衣法图2制备方法使用率比较

1－－乳化法，2－－静电法，3－－聚合法，4－－沉积法，

5－－相分离法，6－－喷雾干燥法，7－－溶剂蒸发法42ppt课件

四、

微囊化培养技术要点:操作：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养；生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成；培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统；微囊直径控制在200-400μm为宜。

43ppt课件五、动物细胞微囊化的制备主要是应用海藻酸—聚氨基酸的方法

简单过程：动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙(cacl2)溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。动物细胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是关键材料。44ppt课件针头CaCl2液微珠磁力搅拌器（微囊发生器）海藻酸/细胞悬浮液聚氨基酸柠檬酸45ppt课件聚赖氨酸/海藻酸微囊化步骤：1.悬浮细胞胶状液；2.成滴器；3.胶化小珠；4.包被溶液；5.显微镜下微囊；6.多孔微囊膜；7.完成操作后的微囊。46ppt课件

制备注意事项：

●温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；

●所用试剂和膜材料对细胞无毒害；

●膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；

●膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。

47ppt课件①