液相色谱仪操作规程课件

生产过程检测

生产过程检测1.紫外分光光度计操作规程1.目的：规范752型分光光度计标准操作。2.范围：生产过程检测岗位

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3.职责：本岗位操作人员。4.内容：

4.1检查。4.1.1检查生产场地、设备、容器是否清洁。4.1.2检查仪器是否处于正常状态，样品室内有无样品遗留。4.2开机操作。4.2.1将灵敏度旋钮调到1档。4.2.2开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T“，波长调至测定用波长，仪器预热20min。4.2.3打开样品室盖，放入比色皿，调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上样品室盖，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。4.2.4预热后，按4.2.3连续几次调整“0”和“100%”，即可进行测定工作。4.2.5吸光度A的测量，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使数字显示为“.000”，然后按被测样品移入光路，显示值即为被测样的吸光度值。4.3关闭电源，清洁比色皿。5.注意事项：5.1盛装样品溶液以比色皿体积的4/5为宜。5.2比色皿使用后要彻底清洗。5.3严禁用手指触摸比色皿的光面。

2．普通光学

显微镜操作规程

1.目的：规范普通光学显微镜标准操作。2.范围：生产过程检测岗位。

3.职责：本岗位操作人员。4.内容：

4.1检查。4.1.1检查生产场地、设备、容器是否清洁。4.1.2检查显微镜的光学部分和机械部分。4.2取镜。4.2.1正确拿取显微镜，做到“一握、一托、镜身直”。4.2.2将显微镜放置于距桌边10cm的距离。4.3对光及低倍镜使用。4.3.1用粗调，使载物台上升，转动物镜转换器，使低倍镜与镜筒成一直线，打开光圈，左眼观察，调节反光和聚光器。4.3.2缓慢转动粗调直到看清，再转微调。4.4高倍镜使用。4.4.1先在低倍镜下找到物像，将物象调到视野中央。4.4.2转换物镜转换器移高倍镜到位，缓慢转粗调直到出像；然后转用微调。4.5油镜使用。4.5.1先用低倍镜找到被观察物，将观察物移入中央。4.5.2转动油镜，载玻片内加香柏油一滴，从右观察，使镜头进入油中，几乎接近载玻片。4.5.3开大光圈，轻调粗调，再用微调看清为止。4.5.4观察完毕，用二甲苯擦净油镜，然后用干净的擦镜纸擦净。4.6还原。4.6.1物镜转离通光孔成八字，下降载物台至底部，反光镜水平。5.注意事项：5.1拿显微镜要做到“一握，一托，镜身直”，取用过程应避免碰撞。5.2显微镜是精密、贵重仪器，应注意细心爱护，不得随便拆卸。5.3从高倍镜和油镜下取出标本时，必须先提升镜筒，将镜头转离通光孔，方可取出。5.4保持清洁，一切光学部分，尤其是物镜和目镜镜头，禁止用手触摸。

4．液相色谱仪操作规程1.目的：规范Agilent1100型液相色谱仪标准操作。2.范围：生产过程检测岗位

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3.职责：本岗位操作人员。4.内容：

4.1检查。4.1.1检查生产场地、设备、容器是否清洁。4.1.2检查仪器是否处于正常状态，电源是否正常。4.2开机操作。4.2.1打开主机箱门，在进样阀和检测器间安装合适的色谱柱。4.2.2打开计算机电源开关，打开LC电源开关。4.2.3打开柱箱电源开关，设定分析温度。4.2.4双击计算机桌面上的Instrumentonline图标进入工作站系统。4.3编辑LC分析法。4.3.1在Instrumentonline主界面上选择Method-EditEntireMethod。4.3.2根据提示编辑完所有的LC参数。设定合适的泵流量和检测器波长，保存所编辑的方法。4.4样品分析与采集数据。4.4.1在Method￡Runcontro界面上选择File-Load-Method，选择分析方法文件。4.4.2在Method￡Runcontro界面上选择Runcontro-SampleInformation，依提示输入相关信息，进样后即自动开始样品分析与数据采集。4.5报告输出。4.5.1在Instrumentonline主界面上选择View-DataAnalysis界面。4.5.2选择所要处理的数据文件及报告格式，输出报告。4.6关机。

4.6.1待全部样品分析完后约30min,方可关机。4.6.2用适宜溶剂清洗进样阀和进样器。4.6.3在Instrumentonline主界面上退出色谱工作站。4.6.4依次关闭柱箱电源，LC电源和计算机电源。5注意事项：5.1样品均用0.45μm的滤膜过滤后才可进样。5.2所有溶剂均选用HPLC级试剂。一、记录发酵参数

在发酵过程中按时记录发酵罐控制系统上显示的pH值，温度，溶解氧浓度，压力和搅拌转速，并做出相应控制。

在生产过程检测中，需要检测的发酵参数较多，这些参数的真实性、准确性直接影响着发酵生产。二、镜检

1．涂片取一干净的载玻片，在酒精灯上灭菌，滴一滴生理盐水于载玻片中央，无菌操作取少许发酵液于水中并均匀地涂成菌膜，扩大为水滴的3-4倍。2．干燥将载玻片自然干燥，或风机吹干，或酒精灯上方烘干。3．固定载玻片“过”火焰，不要烤。4．染色在菌膜上滴亚甲蓝染色液1-2滴，染色2-3min。5．水洗斜置载玻片，以细水流从上端缓慢洗去菌膜上多余的染色液，然后轻轻甩去玻片上的水。6．干燥自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上剩余水分。7．镜检在光学显微镜下观察菌体的形态是否正常，以及是否有杂菌。三、菌体浓度检测

1．体积测量法体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积发酵液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。(1)取一定量的待测发酵液（如10mL）放在有刻度的离心管中。(2)离心设定一定的离心时间（如5min）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清液。(3)测出上清液体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。2．干重法干重法是指细胞培养液经离心或过滤后收集细胞或菌丝体，洗涤，干燥后称重的方法，依操作方法可分为离心法和过滤法。(1)在离心法中，将一定体积发酵液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心；(2)再用蒸馏水洗涤、离心沉淀1-5次，进行干燥。(3)干燥可用烘箱在105℃或100℃烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥至恒重后称重。3．比浊法微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下培养物的吸光值，判断微生物的生长状况。取少量发酵液稀释至适当倍数，采用紫外可见分光光度计测定OD600值。

四、基质浓度检测

1．还原糖测定

(1)吸取0.5mL样品，加入10mL盐酸，加热水解得到淀粉水解物。

(2)在淀粉水解物中加入10mL斐林试剂Ⅰ和斐林试剂Ⅱ，煮沸3min，溶液成蓝色。

(3)蓝色产物中加入5mL碘化钾和10mL盐酸（6mol/L），滴定硫代硫酸钠，中途加淀粉指示剂，继续滴定硫代硫酸钠直到蓝色退去。

(4)记录样品所消耗的硫代硫酸钠的量，与空白所消耗的硫代硫酸钠的量相减，差值查标准糖含量表得其含糖量。

2．氨基氮测定（甲醛法总氮测定）(1)取50mL蒸馏水，加入5mL样品、2滴甲基红指示剂和1滴硫酸。摇匀，样品变红。

(2)加入氢氧化钠使溶液为黄色。

(3)黄色溶液中加入10mL甲醛缓冲液，摇匀，静置10min。

(4)滴定氢氧化钠，溶液由黄色变为红色。记录所消耗的氢氧化钠的量，查氨基氮含量表，可得含氨基氮的量。

同学们务必工作认真负责，严格按生产规程进行操作；及时做好相关生产记录。五、产物浓度检测

取适量发酵液，经滤纸和微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱测定。色谱条件：以HAc-NaAc缓冲液一乙腈(体积比80:20)作流动相。检测波长为254nm，流速1.2mL/min。进样量20μl，柱温25℃，柱型DiamonsilC18(4.6mm×250mm)，采用外标法测定样品中的青霉素效价。

遵守生产纪律，确保安全生产；爱护仪器设备，做到定期维护。六、操作注意事项

(1)紫外分光光度计操作时应注意，盛装样品溶液以比色皿体积的4/5为宜，防止溶液流入样品室污染仪器；比色皿使用后要彻底清洗干净。(2)普通光学显微镜操作时应注意，观察水浸标本片时应盖上盖玻片；降下镜筒时，宜慢忌快，注意物镜与标本片之间的距离，谨防损坏镜头。(3)高效液相色谱仪操作时应注意所有样品均用0.45μm的滤膜过滤后才可进样；所有溶剂均选用HPLC级试剂。(4)设备操作前应进行设备状态与完好检查，辅助设备检查。(5)设备操作结束后清场。七、评价方法实训评分标准1.镜检技术----------------------------------------------------15分2.菌体浓度检测----------------------------------------------10分3.基质浓度检测----------------------------------------------20分4.紫外分光光度计正确操作-------------------------------20分5.产物浓度检测----------------------------------------------20分6.遵守职场行业制度----------------------------------------15分基础知识一、发酵检测目的及意义1．发酵检测目的发酵过程检测是为了取得发酵参数及生产菌株的生理生化特征数据，以便对发酵过程实施有效的控制。2．发酵检测意义(1)了解过程变量的变化是否与预期的目标值相符；(2)决定种子罐移种和发酵罐放罐的时间；(3)对不可测变量进行间接估计；(4)对过程变量按给定值进行手动控制或自动控制；(5)通过过程模型实施计算机控制。二、控制发酵

过程的主要参数

1．pH值（酸碱度）发酵液的pH值是发酵过程中各种生化反应的综合结果，它是发酵工艺控制的重要参数之一。pH值的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。2．温度温度是指发酵整个过程或发酵不同阶段所维持的发酵罐温度。温度的高低与发酵中的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等有密切关系。3．溶解氧浓度溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。4．菌体浓度菌体浓度的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响，在生产上，常常根据菌体浓度来决定适合的补料量和供氧量，以保证生产达到预期的水平。5．基质浓度基质浓度是指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。6．产物浓度产物浓度是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。7．压力压力是指发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入而避免污染，以保证纯种的培养。8．搅拌转速对于好氧性发酵，在发酵的不同阶段控制不同的搅拌转速，可以调节发酵液中的溶解氧浓度。三、发酵染菌

发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。1．发酵罐染菌后的异常现象发酵染菌后由于染菌导致发酵过程中的某些物理，化学或生物参数发生与原有规律不同的改变，在工艺控制和发酵过程表现上出现异常的反应。(1)发酵液的pH发生变化。(2)发酵罐罐温升高。(3)菌体浓度异常。(4)发酵液气味和黏度变化。(5)泡沫过多。(6)代谢异常。(7)溶解氧浓度。2．发酵染菌的检测发酵过程出现的异常现象可以及时发现发酵染菌的情况