蛋白质合成分离

蛋白质合成分离第一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二意义解析蛋白质结构与功能的关系，为应用及人工合成蛋白质提供全面信息；许多肽具有独特的生物学活性，是目前合成的主要物质；第二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一节肽合成合成肽的方法有三类第一类是由不同氨基酸按照一定顺序的控制合成；第二类是由氨基酸自由共聚；第三类由酶催化在非水介质中合成。第三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二

第一类是目前合成肽的主要方法，该方法在合成前必须先将不参与形成肽键的活泼基团保护起来。例如，羧基可用活性酯法（酰氯），氨基可以采用碳二亚胺法形成卞氧甲酰胺，合成后再将保护基水解下来。最后分离产物。第四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二80年代，开发出固相合成技术。合成肽链时，在聚苯乙烯树脂小珠固相上进行。⑴待合成的第一个氨基酸的羧基先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，共价地挂接在树脂上。⑵除去该氨基酸的N-末端保护基;⑶第二个氨基酸（氨基被保护）以碳二亚胺为缩合剂，接到第一个氨基酸的氨基上；⑷除去第二个氨基酸的氨基保护基；重复上述步骤，使肽链按控制顺序从C端向N端延长。合成一个十肽，花费27小时，产率85%。第八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二肽链合成到最后一步时，把树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥的HBr，使肽与树脂脱离，同时也切除保护基团。现在多肽合成仪上进行，反应杯中的试剂按程序泵入和除去。第九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第二类实际上在讲氨基酸成肽反应时已经讲过，从理论上讲，该反应在工业上可以用来制备聚氨基酸，但是该反应没有选择性。第三类是用酶合成，在水环境下，合成肽需要消耗能量（ATP）；在非水条件下，蛋白酶等水解酶可转变成合成酶，将氨基酸合成肽。而且不需要消耗ATP。该法优点是条件温和，步骤少，缺点是氨基酸或肽的溶剂体系选择以及合成物的卸载。第十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二近25年来，生物催化剂在非水介质中催化反应以及应用的研究论文呈现爆炸性增长。这里的生物催化剂主要指酶，非水介质包括微水有机溶剂体系；反胶束体系；水-水不互溶两相体系。在有机介质中，酶改变反应方向，例如水解酶变成合成酶；刚性增加，对底物的专一性大大提高；热稳定性显著提高；可重复使用；避免微生物污染；可对水敏感的底物进行催化。非水介质中生物催化简介第十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二酶催化的反应氧化还原酶转移酶第十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二水解酶裂合酶异构酶合成酶第十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二酶分子在非水介质中主要以下列形式存在，即：固态-冻干粉或固定化酶或结晶酶；可溶解酶-水溶性大分子修饰酶；非共价修饰的高分子-酶复合物、表面活性剂-酶复合物、乳液酶等；在非水介质中酶能保持整体结构的完整性；其活性部位的结构与在水溶液中相同；非水介质中酶的状态第十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二非水介质中的酶学性质非水介质中，酶分子内的氢键起主要作用，导致其〝刚性增加〞，维持其活性中心的构象与在水介质中的一致。

第十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二在非水介质中，酶与介质间的疏水相互作用平衡改变，导致酶的专一性、催化性质等受到影响酶的稳定性提高，例如脂肪酶酶的特异性不变，但是对底物的催化效率会发生变化，即催化效率增加了分配系数项第十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二微量水的影响是影响非水介质中酶活力及选择性的控制步骤水的作用：调控酶构象微量水对酶发挥有效催化是必需的，水分子直接或间接参与酶稳定构象的各种非共价作用，弱化荷电基团或极性基团间的相互作用，增加酶柔性及选择性第十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二非水介质中酶结合水的位点及结合量离子化基团水化：与酶分子表面的荷电基团结合；结合量0-0.07g/g酶极性水族生长：与酶分子表面极性基团结合；结合量0.07-0.25g/g酶弱吸附：与酶表面弱极性区域结合；结合量0.25-0.38g/g酶完全水化：酶蛋白表面完全水化；结合量0.38g/g酶第二十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第二十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二非水介质中酶催化反应类型及应用酶催化反应的类型C-O键的形成，包括酯合成、环氧化、糖苷合成、加氧氧化C-N键的反应，包括肽的合成C-C键的形成，包括羟醛、酮醛和羟醛转移、醛缩合、醛加成等还原反应氧化反应，包括C-H、C=C氧化，醇氧化，酚氧化，羧酸氧化，C-N氧化，异构化反应形成C-X的反应（卤化反应）包括烯烃、炔烃、芳香族及含有活泼的C-H键的化合物的卤化。第二十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二酶非水催化反应的应用⑴制备光学活性化合物⑵合成旋光性高分子⑶糖和类固醇的选择性催化⑷功能性高分子合成⑸可生物降解高分子的酶促合成第二十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二合成肌肽及其类似物存在于动物肌肉中的肌肽是由β-丙氨酸与L-组氨酸组成的二肽，具有抗氧化、清除自由基，pH缓冲等生理功能。其最显著的性质是抗氧化，主要表现为捕获活性氧和自由基，螯合金属离子，结合脂肪酸氧化产物-醛，是迄今发现的最有效天然抗氧化、抗衰老二肽。第二十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二肌肽及其类似物的结构式第二十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二正丁醇中合成肌肽

40℃、pH6.5，转化率84.26%第二十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二四氢呋喃中合成肌肽类似物

50℃、pH8.5，转化率76.35%第二十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第二十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二合成硬脂酰三乙醇铵单酯硬脂酰三乙醇胺盐酸盐是一种季铵化合物，在日化行业主要用于洗发香波中，中和头发蛋白质的负电荷及抗菌。该分子在头发上的附着力强，产生〝飘逸〞效果，但无光亮。该物质目前采用酸催化剂在140℃左右脱水合成第二十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二用脂肪酶在正己烷中合成，合成温度55℃，转化率72.75%，酶可以反复使用多次。

第三十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二合成羟基脯氨酸双酯羟基脯氨酸（L-Hyp），修饰氨基酸，抗自由基、抗衰老，日化行业在功能性皮肤化妆品中使用。脂/水平衡系数低，不能透过皮肤细胞膜。目前采用两步法化学合成。单酯合成温度达120℃，苯系物为带水剂，双酯的合成方法未见公开报道。由于其吡咯环的干扰，预计合成温度将超过160℃，伴随单酯键部分水解。第三十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二合成羟基脯氨酸双酯

无溶剂、脂肪酶、60℃、6-8h，转化率超过93%第三十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二酯交换合成单酯第三十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二单酯酯化合成双酯第三十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第二节蛋白质分子量测定

⒈最小分子量如血红蛋白含0.335%铁，其最低分子量=16700⒉渗透压法π=RT（c/Mτ+Kc2）,Mτ=RT/lim(c0)π/C第三十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第三十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⒊凝胶过滤Ve/Vo=a-blogMτ

式中，Ve为洗脱液体积，Vo为外水体积，Mτ为相对分子质量，a，b为常数。移项得：logMτ=a/b-1/b（Ve//Vo）基于蛋白质主要呈球状，假设分子量相同，其分子体积及直径相同。先测几种标准蛋白质的Ve，以其相对分子质量的对数（logMτ）对Ve作图，得一条直线。再测样品的Ve，即可从图中查出其相对分子量。第三十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第三十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第三十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⒋SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳这是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。基于被分离物质的分子大小和电荷。①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N’-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。第四十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二②聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的高聚物，聚合前调节单体浓度比，使之既有适宜的空隙度，又有较好的机械性质。第四十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二③丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在水溶液中通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。

聚合反应的催化剂包括引发剂和加速剂。引发剂使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则加快引发剂释放自由基的速度。④聚丙烯酰胺热稳定，无色透明，可肉眼观察或用检测仪测定。第四十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二常用的引发剂和加速剂的配伍如下表：

引发剂

加速剂（NH4)2S2O8

TEMEDN，N，N，N';四甲基乙二胺

(NH4)2S2O8DMAPNβ－二甲基胺基丙晴核黄素

TEMED第四十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二

用过硫酸铵引发的反应为化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，为光聚合反应。聚丙烯酰胺聚合反应受下列因素影响：

1、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止（空气隔绝）。

2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应（选择容器材质）。

3、某些试剂可以减慢反应速度，如赤血盐（电位）。

4、温度高聚合快，温度低聚合慢（控温）。

第四十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二每100mL凝胶溶液中含有单体和交联剂的总质量数（g）称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶中交联剂占单体或交联体质量的百分数称为交联度，常用C%表示。此外，聚丙烯酰胺凝胶还有分子筛效应。电泳迁移率与肽链分子量的对数有如下关系：logMτ=a-bμR

或logMτ=K1-K2μR式中μR为相对迁移率=样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离，其余为常数。第四十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二测定时，以几种标准物蛋白质的Mτ的对数值对其μR值作图，根据待测样品的μR，从标准曲线上查出它的Mτ。含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，适用于分离1万至100万物质，1万以下的则采用15-30%的凝胶，分子量特别大的采用含4%的凝胶。第四十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠（SDS）是一种有效的蛋白质变性剂，它能破坏蛋白质的氢键和疏水作用。SDS与蛋白质结合使变性蛋白质带负电荷，覆盖于多肽链上，数量远远超过蛋白质所带电荷。第四十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第四十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二SDS改变了蛋白质单体分子的构象SDS蛋白质复合物呈近似雪茄的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合体直径（短轴）都是一样的，约为1.8nm，而长轴长度却随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。因此，电泳时蛋白质迁移率仅与其分子量相关。第四十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二因此，在电泳时以同样的电荷/蛋白质比(荷质比）向正极方向移动；消除了蛋白质原有的电荷、分子形状等因素的影响。第五十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二常用的电泳方法除了凝胶电泳以外，还有区带电泳：支持介质为薄膜、纸等；等电聚焦电泳（IEF）：以两性电解质为电泳介质，将其制备成pH梯度，分离蛋白质等带电离子的方法。两性电解质是由多种氨基与羧基比例不同的多氨基多羧酸的混合物构成，例如丙稀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、亚甲基丁二酸等；常用的脂肪胺有乙二胺、二乙烯三胺、乙醇胺等。将上述的酸与胺进行加成反应获得。第五十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二当被分离的蛋白质到达其等电点区间时，以兼性离子存在，静电荷为零，既不向正极、也不向负极泳动；等电聚焦电泳分辨率高、可大规模使用，用于分析和工业制备。现在已经有规模化生产的两性电解质销售。第五十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第三节蛋白质的盐溶与盐析盐溶：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响，在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，称盐溶。盐溶是蛋白质吸附盐离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水之间的作用加强，溶解度增高。第五十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二盐析：指蛋白质在高浓度中性盐存在时从溶液中沉淀析出的现象盐析时，同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响，要比单价大。中性盐影响蛋白质溶解度的能力是其离子强度的函数。离子强度定义为：I=1/2∑CiZi2Ci为离子的浓度，Zi为离子的净电荷第五十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二计算溶液的离子强度，可将各种离子的浓度分别乘以各种离子所带的净电荷的平方，然后将所有乘积相加并除以2。例如，2mol/L硫酸铵溶液的离子强度为：［（4×1）+（2×2）］/2=6第六十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二在盐析时，要加入的硫酸铵可用下式表示：⑴0℃，硫酸铵浓度由饱和度S1增至S2，应向1升溶液中添加的固体硫酸铵克数：W=505（S2-S1）/（1-0.285S2）S1和S2分别表示起始和终了饱和度.饱和度是在给定条件下某中性盐达到的最大百分浓度；505是0℃时1000mL饱和硫酸铵(100%或1.00饱和度)溶液中所含的硫酸铵克数(505g/1000毫升溶液);⑵将100mL硫酸铵溶液,由饱和度S1

变为S2,应向其中加入饱和硫酸铵的毫升数V:V=100(S2-S1)/(1-S2)第六十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第四节蛋白质的性质一、蛋白质的可解离基团蛋白质分子中可解离基团的pKa值第六十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二二、蛋白质的胶体性质蛋白质分子达到胶体质点的范围，具有胶体所有的性质，特别是不能通过半透膜。半透膜：能让水和小分子物质自由通过的膜。蛋白质分子表面分布大量亲水侧链，水溶液中蛋白质分子表面形成一层水膜，吸水量为0.3～0.5克/克蛋白。许多可解离的基团，与周围相反电荷的离子形成盐键,即双电层。第六十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第六十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二三、蛋白质的两性性质和等电点蛋白质分子中的可解离侧链基团，有的与酸作用，有的与碱作用，是两性电解质。等电点：某一pH值时，蛋白质所带正电荷和负电荷相等，即净电荷为零，此时溶液pH值称该蛋白质的等电点。第六十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第六十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二等电点时蛋白质分子中可解离侧链基团的净电荷为零，双电层几乎消失，溶解度最小。等离子点：等电点与介质的离子组成、pH变化有关，故测定等电点要在确定的pH、离子强度的缓冲液中进行。纯水中测得的等电点称等离子点。第六十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二几种蛋白质的等电点

第六十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系第六十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二四、蛋白质变性和复性变性作用：蛋白质受某些物理化学因素的影响，空间构象破坏导致的理化性质，生物学活性改变的现象。变性是蛋白质二级结构以上的高级结构的破坏而导致生物活性丧失的过程。变性因素：强酸、强碱、剧烈搅拌、重金属盐、有机溶剂、脲、胍类、超声波、加热等。第七十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二变性结果：溶解度降低，不对称性增加，结晶能力丧失，易被蛋白酶水解。可逆变性：指除去变性因素后，变性蛋白质的空间结构恢复，使生物学活性恢复。不可逆变性：指除去变性因素后，变性蛋白质的空间结构及生物学活性不能恢复。复性：变性蛋白质恢复空间结构及生物学活性的过程。第七十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二五、蛋白质的沉淀水化层和双电层是蛋白质溶液稳定的两个主要因素，破坏其中的一个或两个都可使蛋白质变性而沉淀析出。这种变性蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀作用。第七十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二1.可逆沉淀：指除去沉淀剂后，使蛋白质恢复溶解状态。盐析；盐析作用破坏双电层并夺去蛋白质水分。盐溶；形成双电层2.不可逆沉淀

重金属盐、有机溶剂、生物碱试剂等都能使蛋白质生成不可逆沉淀，不能用透析等方法除去沉淀剂，使蛋白质重新溶解。第七十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑴.重金属盐在碱性条件下蛋白质带负电荷，可与Hg、Pb等重金属离子结合，形成不溶性的盐沉淀。

NH2NH2Pr+Hg2+PrCOO-COO-:Hg2+第七十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑵.生物碱试剂生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等

第七十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑶.有机溶剂乙醇、丙酮等可破坏蛋白质的水膜，降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间的静电作用增加，而聚集沉淀。介电常数：电荷被真空隔绝时的电势与被介质隔绝时的电势之比值。第七十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第七十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二六、蛋白质的沉降作用溶液中的蛋白质在离心力作用下会发生沉降运动，沉降速度与蛋白质分子的大小和密度有关，也与蛋白质分子的形状、溶剂的密度和粘度有关。在离心场中蛋白质分子受到的净离心力（离心力—浮力）与摩擦阻力平衡时，单位离心场强度的沉降速度是定值，称为沉降系数（S表示）。S=1×10-13s。扩散系数：当浓度梯度等于1单位时，在1s内通过1cm2面积而扩散的溶质量。（g/cm2s）以蛋白质的S及扩散系数，可按下式计算蛋白质的相对分子量第七十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二

M=RTS/D（1-νρ）R——气体常数，R=8.314J/molKT——绝对温度，KS——沉降系数，SD——扩散系数ν——蛋白质的微分比体积（当加入1克干物质于无限大体积的溶剂中，溶液体积的增量）ρ——溶剂的密度，g/cm3第七十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二七、蛋白质颜色反应第八十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第五节蛋白质分离纯化和测定一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在细胞中都和核酸等生物大分子结合在一起；许多蛋白质在性质、结构上有许多相似，目前，还没有一种方法能适应多种蛋白质的提取、分离和纯化。蛋白质分离纯化的基本原则如下：材料：目标物浓度高、新鲜；采用温和方法处理；尽量避免活性损失。第八十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二1.材料预处理及细胞破碎材料选择：选择目标蛋白含量高，容易提取的材料；若要制备有活性的蛋白质，所用材料须新鲜且含量高。⑴材料预处理①丙酮干粉：如果要制备的蛋白质对丙酮不敏感，可制成丙酮干粉（反复用4-8倍体积的冷丙酮脱水），以防止蛋白酶的水解及温度变化带来的变性。②冰箱及液氮罐保藏冰箱-20℃，液氮-193℃。可长期保藏。第八十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑵破碎细胞释放蛋白质破坏细胞的方法有：①机械破碎法；利用机械力的搅切作用破坏细胞壁和细胞膜。高速组织捣碎机，匀浆器，研钵。第八十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二②渗透破碎：利用低渗条件使细胞膨胀而破碎。③冻融法：利用细胞内冰晶破坏膜结构，反复进行多次。但温度敏感蛋白不用此法。④超声波法：超声波使细胞膜受张力不均破裂，超声波震荡器。⑤酶法：溶菌酶破坏微生物细胞膜。第八十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第八十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第八十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第八十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二2.蛋白质抽提根据要制备的蛋白质的性质，选择合适的溶剂将蛋白质与其它组分分开。合适溶剂是指选择有适宜的pH、离子强度、组成成分等的缓冲液。例如磷酸盐缓冲液柠檬酸缓冲溶液等。抽提过程中是在低温下进行的，要注意将温度控制在4～10℃；提取时需要强化传质，往往使用搅拌器，但是要注意避免剧烈搅拌或使用过大的剪切力，以防止蛋白变性。第八十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二3.获得蛋白粗品即从抽提液中获得初步分离蛋白质，常用的方法有：⑴等电点沉淀法；调节提取液pH，达到目标蛋白的等电点。⑵盐析法；盐析分离的蛋白仍保持天然性质并能再度溶解。一般使用中性盐，例如最常用硫酸铵。但硫酸钠、磷酸钾效果最好。第八十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑶有机溶剂沉淀法使用与水可任意互溶的小分子有机溶剂，例如乙醇和丙酮它们从蛋白质分子表面大量夺取水分子，迫使蛋白质通过相反电荷间的吸引力聚集，溶解性降低，进而沉淀下来。调节溶液pH，使其到达蛋白质的等电点附近时再加入有机溶剂，则沉淀效果更好。有机溶剂破坏蛋白质表面的水膜时要放热，可能导致蛋白质变性，应尽量在低温下操作并选择合适的有机溶剂浓度。第九十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二二、分离纯化的主要方法用上述方法得到的蛋白质粗品还混有其它蛋白质及非蛋白杂质，须进一步分离纯化才能得到可用于医药或工业等的产品。常用的纯化方法有：⒈离子交换色谱⒉分子排阻色谱⒊亲和色谱⒋疏水色谱等常需要联合使用这些方法才能获得较高纯度的样品。第九十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二1.分子排阻色谱又称凝胶过滤法，分子筛色谱。该法使用一种凝胶即交联葡聚糖，商品名Sephadex。这种物质由水溶性的葡聚糖（Dextran）和环氧氯丙烷交联而成。控制交联剂用量，可控制凝胶网格大小，利用网孔大小分离纯化蛋白质（体积大，孔外最先流出、小者次之、体积与空相近最后流出。）凝胶过滤分离蛋白质图第九十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第九十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第九十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第九十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二离子交换纤维素是人工合成的纤维素衍生物，其解离基团可与带电荷的蛋白质交换达到分离纯化。⑴羧甲基纤维素（CM-纤维素）带羧甲基基团（纤OCH2COOH），是一种阳离子交换剂。在中性pH条件时，羧甲基上的质子可解离下来，与溶液中带正电荷的蛋白质交换。2.离子交换柱色谱法纤维素颗粒

或琼脂糖O

CH2CH2

O-

第九十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑵二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)这是一种阴离子交换剂（纤OCH2CH2N+（C2H5）2，在中性pH条件时，它含有带正电荷的基团，可与带负电荷的蛋白质交换。纤维素颗粒

或琼脂糖H+C2H5

CH2CH2N

C2H5

第九十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二离子交换树脂第九十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二离子交换树脂结构第九十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二离子交换原理第一百页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百零一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二离子交换器第一百零二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑶亲和色谱据酶与底物专一结合的原理，设计配基，使其能专一与酶结合，再与惰性载体连接，制成亲和层析柱。效率特别高。如伴刀豆球蛋白A的纯化，伴刀豆球蛋白A对葡萄糖有专一性亲和吸附，将葡萄糖连接到琼脂糖凝胶上，再行纯化。CH2CH2CH2被吸附的蛋白质分子琼脂糖颗粒特异的配体连接臂第一百零三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二交联壳聚糖接枝L-Hyp亲和吸附树脂羟脯氨酸（L-Hyp）是合成治疗皮肤病、关节炎、肿瘤、减肥及促进伤口愈合等药物的原料，需求量不断增加。目前的生产方式：以离子交换树脂从酸水解胶原蛋白液中分离、洗脱结晶制得。离子交换分离精度低，需多根树脂柱连续分离才能获得产品，产生大量含氨基酸的洗脱废液。第一百零四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二壳聚糖及其交联微球制备壳聚糖分子：以氢键连接，比表面积小，传质阻力大，机械强度低交联壳聚糖微球：席夫键连接，布满微孔，传质阻力小，适当机械强度。第一百零五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百零六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百零七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百零八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二亲和分离氨基酸对L-Hyp0.58mmol/g，对Pro0.24mmol/g动态吸附交换容量0.58mmol/g，对Gly、Phe、Pro动态交换容量依次为0.09、0.08、0.24mmol/g，基本不交换其它氨基酸，可以一次性获得以Hyp和Pro两氨基酸为主的混合物。第一百零九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百一十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百一十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百一十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二第一百一十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二⑷高效（压）液相色谱（HPLC）快速、灵敏、分辨率高、自动化程度高等优点。⑸疏水色谱使用疏水凝胶作分离介质，高浓度盐情况下，蛋白质疏水性增加，与疏水介质结合。然后逐渐降低盐浓度，不同蛋白质因疏水性不同依次被洗脱而达到纯化目标。第一百一十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二反胶束萃取蛋白质反胶束(reversemicelles):表面活性剂在有机溶剂中形成的内核含微量水分的纳米级球形体。反胶束的形态：球形或近似球形，也有呈柱状。极性核(polarcore):表面活性剂分子自组装形成的亲水性内环境。微水相或“水池”(waterpool)：反胶束内溶解的水。

第一百一十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二A

B

第一百一十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期二基本性质内水池直径d：反胶束的大小与溶剂和S的种类与浓度、温度、I等因素有