蛋白质共价结构生物化学

蛋白质共价结构生物化学第一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质共价结构内容提要重点：

肽的结构和性质掌握：

肽段中氨基酸序列的测定方法了解：

肽和蛋白质的人工合成第二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一§4-1蛋白质通论蛋白质概念蛋白质的化学组成蛋白质的分类蛋白质的大小和分子量蛋白质的构象蛋白质功能的多样性蛋白质氨基酸顺序的遗传编码第三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一一、蛋白质概念蛋白质是由20种a-氨基酸通过肽键组成的高分子有机物.第四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一二、蛋白质的化学组成蛋白质由C、H、O、N四种元素组成，多数含有S，有的含有微量铁、铜、锌、碘和磷等元素。各种蛋白质的含氮量都接近于16％蛋白质含量=蛋白氮

6.256.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的基础。

碳50％-55%氢6.5-7.3％氧19-24％氮16%硫0-3％其他微量第五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一三、蛋白质的分类蛋白质分子形状：球状蛋白质：globularprotein

对称性好，溶解度高，能结晶，多数蛋白质属于此类；纤维状蛋白质：fibrousprotein

对称性差，分为：可溶性纤维状蛋白质（肌球蛋白）；不溶性纤维状蛋白质（胶原蛋白、丝心蛋白等）。蛋白质分子组成：简单蛋白质：(simpleprotein)

完全由氨基酸构成，如胰岛素；结合蛋白质：(conjugatedprotein)

由蛋白质和辅基组成，如血红蛋白等。生物功能：酶、结构蛋白、防御蛋白等。第六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一四、蛋白质的大小和分子量

分子量变化范围从大约6,000到1,000,000道尔顿(dation)或更大。蛋白质分子量的上下限是人为规定的。在表示蛋白质分子量时应说明测定方法(层析、电泳、质谱）。有些寡聚蛋白质的分子量高达数百万甚至数千万，例如烟草花叶病毒（TMV），“分子量”约4×107。第七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一五、蛋白质的构象肽链形成的蛋白质的特有的空间结构即为蛋白质的构象。如蛋白质二级结构：a-螺旋、β-折叠等。第八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一六、蛋白质功能的多样性作为有机体新陈代谢的催化剂（酶）。生物体的结构成分(胶元蛋白)。贮藏功能（作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。）运输功能（血红蛋白）。运动功能（肌动蛋白和肌球蛋白）调节功能（激素）参与高等动物的免疫反应（抗体和免疫蛋白）。控制或调节遗传物质核酸的作用（组蛋白）。第九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一七、蛋白质氨基酸顺序的遗传编码三个连续的碱基顺序为一个密码单位即密码子或密码三联体，每个三联体代表一个氨基酸。每条多肽链的氨基酸顺序由RNA的碱基顺序决定，而RNA的碱基顺序决定于DNA，因此一条多肽链的氨基酸顺序最终由DNA分子中的一段碱基顺序所决定。第十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一§4-2蛋白质的共价结构

-肽（peptide）一、蛋白质的一级结构二、肽键的性质三、肽平面四、肽链的方向性五、天然存在的活性肽A链B链A链21个aa残基B链30个aa残基一个链内二硫键两个链间二硫键分子量5700第十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一一、蛋白质的一级结构1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。多肽链即为蛋白质一级结构的主体。-NCCNCC-寡肽：由2-10个氨基酸组成的肽。一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。第十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一二、肽键（peptidebond）-C-N-比大多数C-N键短，具有部分双键性质，不能自由旋转。-C-N-键上的H和O原子是反式的。组成肽键的原子处于同一平面。0.127nm键长=0.132nm

0.148nm第十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一三、肽平面-CO-NH-中的四个原子和与它相邻的两个Ca在一个平面上。第十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一四、肽链的方向性在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如果C-端有NH2，说明C-端酰化第十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一五、天然存在的活性肽（activepeptide）生物体内以游离态存在的分子量较小的多肽，这类多肽通常都具有特殊的生理功能。如催产素、加压素、谷胱甘肽、脑啡肽、激素类多肽、抗菌肽、蛇毒多肽等。第十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一谷胱甘肽CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CHNH2COOHCH2SH

谷胱甘肽—存在与动、植物及微生物中：1.参与体内氧化还原反应2.作为辅酶参与氧化还原反应保护巯基酶或含Cys的蛋白质中SH的还原性，防止氧化物积累第十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一§4-3蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。第十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一一、测定蛋白质的一级结构的要求样品必需纯（>97%以上）；知道蛋白质的分子量；知道蛋白质由几个亚基组成；测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。第十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质一级结构测定的基本策略1、测定蛋白质中多肽链的数目；2、拆分蛋白质分子的多肽链，分离纯化各肽链；3、拆开多肽链内的二硫键；4、分析各肽链的氨基酸组成；5、鉴定多肽链的氨基末端残基和羧基末端残基；6、用两种不同的裂解方式裂解多肽链成较小的片段；7、测定各片段的氨基酸顺序；8、用片段重叠法重建完整多肽链的一级结构；9、确定二硫键的形成方式。

第二十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。第二十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).第二十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。第二十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一巯基（-SH）的保护几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).

第二十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一4、氨基酸组成的测定酸水解是主要水解方法，同时辅以碱水解。一般用6mol／LHCl于110oC在真空充氮的安玻瓶内进行水解，时间10－24小时。所得氨基酸不消旋，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。

酰胺基：总量可由水解液中的氮量算出色氨酸：可用碱水解蛋白质，能定量回收色氨酸。蛋白质中氨基酸组成表示方法：每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示每100克蛋白质中含氨基酸的克数表示。第二十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一N-末端分析方法多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（1）二硝基氟苯（DNFB）法（2）丹磺酰氯（DNS）法（3）苯异硫氰酸酯（PTC）法（4）氨肽酶法第二十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（1）二硝基氟苯（DNFB）法

Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。第二十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（2）丹磺酰氯（DNS）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。灵敏度比DNFB法高100倍水解后的DNS-氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。第二十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（3）苯异硫氰酸酯（PTC）法多肽或蛋白质的末端氨基能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（PTC-多肽或蛋白质），它们在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱离。脱去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。重复反应可以用来测定氨基酸顺序。第二十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（4）氨肽酶法氨肽酶是一类肽链外切酶，它能从多肽链的N端逐个地切下氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。第三十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一C－末端测定的方法肼解法；还原法；羧肽酶法第三十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（1）肼解法是目前测定C末端残基最重要的化学方法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。第三十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（2）还原法肽链C末端氨基酸也可用硼氢化鋰还原成相应的a-氨基醇。肽链完全水解后，代表原来C末端的a-氨基醇，可用层析法加以鉴别。第三十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（3）羧肽酶法羧肽酶是一种肽外切酶，它能从多肽链C-端逐个水解。根据不同的反应时间测酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。第三十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一多肽链的部分断裂和肽段的分离可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。酶解法（常用的都是内切酶）A、胰蛋白酶；B、糜蛋白酶；C、嗜热菌蛋白酶；D、胃蛋白酶化学裂解法：A、溴化氰；B、羟氨肽段的分离提纯多肽链断裂法：酶解法和化学法第三十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一胰蛋白酶

Trypsinase要减少胰蛋白酶的作用位点：可通过化学修饰将其侧链基团保护起来。

Lys：马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护-NH2，则不被水解；

Arg：用1，2-环己二酮修饰胍基，则不被水解。增加胰蛋白酶的断裂点：

用氮丙啶处理，则Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链，也具有-NH2，胰蛋白酶就能断裂Cys羧基侧的肽键。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2第三十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一B、糜蛋白酶

ChymotrypsinR1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。

R2=Pro水解受抑制要求：溶液pH8－9-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2第三十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一嗜热菌蛋白酶

thermolysinR2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly水解受抑制。R1或R3=Pro水解受抑制。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2第三十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一胃蛋白酶

PepsinR1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。如Phe－Phe。R1=Pro水解受抑。要求：pH2由于二硫键在酸性条件稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2第三十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一溴化氰只断裂由甲硫氨酸残基的羧基形成的肽键。蛋白质甲硫氨酸含量很少，因此CNBr裂解产生的肽段不多水解产生的肽段可用胰蛋白酶处理成更小的肽段。第四十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一羟氨专一性裂解Asn-Gly-之间的肽键，专一性不强部分裂解Asn-Leu及Asn-Ala键由于各种蛋白质中Asn—Gly键出现的几率很低，所以水解得到的肽段都很大用于分子量大的蛋白质的测序。第四十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一肽段的分离提纯肽段混合物常用以下方法进行分离提纯：凝胶过滤凝胶电泳离子交换纤维素离子交换葡聚糖柱层析高效液相色谱（HPLC