金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎多价疫苗研制和免疫效果评价

金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎多价疫苗研制和免疫效果评价王治才;王登峰;李建军;杨学云;吴建勇;段新华;徐猛【摘要】为研制用于预防金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的免疫疫苗，使用4株血清型为外膜多糖336型(336PS)、荚膜多糖5型(CP5)和荚膜多糖8型(CP8)强毒力金黄色葡萄球菌试制出金黄色葡萄球菌多价疫苗，并通过抗体水平监测、攻毒保护试验以及两个牧场的田间试验对免疫效果进行了评价。抗体水平监测显示，首免后30d即可产生较高的抗体水平，二次免疫后有效抗体水平可持续到产后210d；人工攻毒保护试验显示，疫苗对金黄色葡萄球菌引起的临床型乳房炎的保护率为89%；田间试验结果表明，该疫苗对奶牛临床型乳房炎的保护率在75.2%-83.3%之间，对隐性乳房炎的保护率在49.9%~52.2%之间，免疫组日产奶量较对照组平均提高1.26kg以上。上述结果表明，所试制的疫苗可以显著降低泌乳牛金黄色葡萄球菌引起的临床型和隐性乳房炎发病率并提高产奶量。%TodevelopaStaphylococcusaureusvaccineforbovinemastitisprevention,thepolyvalentvaccinewaspreparedwith4serotypevirulentstrainsconsistingoftype5capsularpolysaccharide(CP5),type8capsularpolysaceharide(CP8)andtype336polysaccharides(336PS).ItsimmuneefficacyagainstStaphylococcusaureusmastitiswasevaluatedbyantibodylevel,challengetrialand2farms'fieldtrial.Theresultsshowedthatthevaccinecouldelicitahigherantibodylevelat30daysafterfirstimmunization,andtheantibodylevelcouldlast210dayspostpartumaftersecondimmunization.Protectionratewas89%forclinicalmastitischallengedwithStaphylococcusaureus.Similarly,theprotectionrateoffieldtrialwas75.2%-83.3%forclinicalmastitisand49.9%-52.2%forsubclinicalmastitis.Themilkyieldincreasedmorethan1.26kginvaccinatedgroupcomparedwithcontrol.Insum,thisvaccinecouldreducetheincidenceofclinicalandsubclinicalmastitisinducedbyStaphylococcusaureus,andincreasedailymilkproductionofvaccinateddairycowsignificantly.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷)，期】2012(046)010【总页数】5页(P1-4,12)【关键词】奶牛乳房炎;金黄色葡萄球菌;多价疫苗;免疫效果【作者】王治才;王登峰;李建军;杨学云;吴建勇;段新华;徐猛【作者单位】新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐830000【正文语种】中文【中图分类】S852.61乳房炎(Mastitis)是造成奶牛养殖业经济损失最主要的疾病之一，也是影响奶制品质量的主要因素。能够引发奶牛乳房炎的微生物有140多种，其中，金黄色葡萄球菌是临床型和隐性乳房炎中最常见的具有致病意义的病原菌［1-2］。对我国2005年以来发表的关于乳房炎流行病学的论文分析发现，16个省、区、直辖市临床型和隐性乳房炎的发病率分别为2%~10%和40%~65%，患病牛奶样中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的分离率为20%~50%和8%~30%，同时也认为金黄色葡萄球菌是当地乳房炎的重要病原［3-6］。近年来，我国对奶牛乳房炎免疫预防的研究越来越多，但应用于本动物和临床免疫的试验报道较少。本研究在对我国部分地区分离的金黄色葡萄球菌病原学、分子生物学和免疫原性研究的基础上，筛选出4株能够覆盖我国奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌主要血清型的强毒力菌株，试制出了对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有良好免疫保护效果的疫苗。现将该疫苗免疫牛后的抗体水平、奶牛人工感染保护效果以及田间试验的结果报告如下。1材料和方法1.1试验动物来自乌鲁木齐市郊A、B两个奶牛场。每个场选3胎次内，距离分娩期30-60d的健康荷斯坦奶牛100头，随机分为免疫组和对照组，每组50头。所选奶牛按照各场围产期奶牛正常饲养条件饲养。1.2菌株本研究中所用的5株金黄色葡萄球菌均从乳房炎奶样中分离。其中，4株编号为MPAN10、XJMP69、XJMP50、XJMP92的金黄色葡萄球菌为本疫苗制苗菌株;金黄色葡萄球菌XJMP49作为攻毒保护实验中的异源攻毒菌株。各菌株详细信息见表1。表1使用菌株的基本信息注：a为多位点测序分型。菌株血清型溶血型MLST型aMPAN10CP5p352XJMP69CP8&2166XJMP50336PS&97XJMP92336PSa邛398XJMP49CP5a邛971.3疫苗制备疫苗抗原的制备参考Leitner方法［7］加以改良，即通过细胞匀浆、酶处理、浓缩，分别制备不同菌株的外膜抗原;通过震摇培养、灭活、离心、浓缩和纯化，分别制备不同菌株的毒素。所制备的抗原-80OC冻存。制苗前，将4株金黄色葡萄球菌的夕卜膜抗原和毒素分别等量混合，再与佐剂按一定比例乳化制苗。佐剂为法国赛比克公司(SEPPIC)生产的MontanideISA70MVG矿物油佐剂。1.4疫苗的检验按照油佐剂疫苗常规检验内容，分别进行无菌、黏度和稳定性检验，合格后进行安全性检验。疫苗的安全性通过注射不同妊娠期奶牛，观察注射后的体温、食欲、精神变化以及产犊情况。1.5免疫途径、程序采用颈部肌肉注射。首次免疫时间为产前40-60d，免疫剂量为3mL/头;在产后30-40d进行加强免疫，免疫剂量为2mL/头。1.6抗体监测在首次免疫前、加强免疫时和加强免疫后30、60、120、180、240d分别随机采集A牛场免疫组和对照组血样各3-5份，分离血清，将同一组的血清等量混合，用间接ELISA方法测定其平均抗体水平。1.7攻毒实验从B牛场选加强免疫60d后、隐性乳房炎检测阴性的免疫牛和对照组牛各9头，分为A、B、C3组，每组免疫牛和对照组牛各3头进行攻毒保护试验。攻毒用金黄色葡萄球菌以哥伦比亚液体培养基37°C震摇培养20h，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液稀释至60CFU/mL,攻毒剂量为5mL(300CFU/乳区)。攻毒时每头牛选同一部位的一个乳区，用通乳针通过乳头管插入乳池，将5mL菌液缓慢注入乳池内，按摩1-2min。攻毒后观察7d。攻毒乳区乳汁异常或乳腺出现红、肿、热、痛等局部症状，或出现体温升高等全身症状，确定为发病牛。同时在攻毒后每12h采集乳汁1次，采用兰州乳房炎检测试剂(LMT)进行隐性乳房炎的检测。免疫保护率按照如下公式计算：免疫保护率(%)=(对照组奶牛发病率-免疫组奶牛发病率)/对照组奶牛发病率X100%。各组攻毒菌株和剂量见表2。1.8田间试验将上述A、B两牛场加强免疫后的牛和同期产奶的未免疫牛为田间试验观察比较对象，进行8个月的跟踪观察和监测，统计首次免疫后8个月内由金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌引起的临床型乳房炎发病情况、二次免疫后第3个月内隐性乳房炎的头阳性率（LMT检测）和二次免疫后第3个月时7d内的平均产奶量。表2攻毒试验分组及使用的攻毒菌株和感染剂量注：A、B和C为金黄色葡萄球菌攻毒组;A和B为疫苗同源菌株组;C为非疫苗异源菌株组。项目分组ABC攻毒菌株MPAN10XJMP50XJMP49攻毒剂量（CFU）3003003001.9奶样中细菌分离鉴定采集田间试验中临床型乳房炎和隐性乳房炎奶样，分别接种于绵羊血琼脂平板和麦康凯琼脂平板，挑取特征性菌落，通过染色和生化实验进行细菌鉴定。2结果2.1疫苗的安全性疫苗注射后观测3d，体温、食欲、运动正常;注射部位出现直径2cm左右的肿块，2周左右消失;免疫牛观察3个月，均无流产、早产或死胎出现，出生犊牛发育正常。2.2免疫牛抗体水平变化二次免疫时（产后30d）抗金黄色葡萄球菌的总IgG水平（OD490nm）达0.79，为对照组（0.36）的2.19倍;二次免疫后30d达到高峰（2.41）。在其后的30-180d,抗体一直维持在较高水平，二免后240d抗体水平才降至对照牛的平均水平（图1）。进行二次免疫时，IgG1和IgG2均达到对照组的1.5倍以上，IgG1的消长趋势和总IgG的趋势基本一致;IgG2在二次免疫后的60d达到高峰，并在二次免疫后30~180d期间处于较高的平稳状态（图2）。经两次免疫，在210d内抗金黄色葡萄球菌的抗体（IgG、IgG1和IgG2）均高于对照组2倍以上。图1抗金黄色葡萄球菌特异性抗体IgG的动态变化备检血清1:2700稀释;A:首次免疫;日：二次免疫;C:产犊图2抗金黄色葡萄球菌特异性抗体IgG1和IgG2的动态变化备检血清1:100稀释;A:首次免疫;日：二次免疫;C:产犊2.3免疫牛攻毒结果攻毒后8~16h,A、B、C组所有未免疫牛均出现不同程度的临床型乳房炎症状：体温升高至39.5°C以上，乳汁呈现絮状乳或血乳，乳区红肿;各免疫组攻毒牛攻毒乳区乳汁呈现隐性乳房炎阳性反应；攻毒72-96h后各免疫组牛LMT检测转为阴性。攻毒后临床型乳房炎发病结果统计显示，仅A组免疫牛有一头发病，其他两组均100%保护，而3组对照牛均发病，发病率均为100%。该疫苗对金黄色葡萄球菌的保护率：A组66.7%;B组100%;C组100%，平均保护率为88.9%(表3)。表3金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎多价疫苗临床攻毒实验结果分组A免疫组对照组B免疫组对照组C免疫组对照组发病数1/33/303/303/3发病率33.3%100%0100%0100%2.4田间保护结果A牛场的田间试验显示，免疫组和对照组分别有1头(2%)和6头(12%)奶牛患临床乳房炎，免疫组比对照组的发病率低10%，对临床型乳房炎的保护率为83.3%。二次免疫后第3个月时，免疫组隐性乳房炎阳性率较对照组降低24%，对隐性乳房炎的保护率为52.2%。统计第3个月时7d内的日平均产奶量，免疫组较对照组高1.26kg，差异显著(P<0.05)(表4)。对此期间患乳房炎(临床和隐性乳房炎)牛奶样进行细菌分离鉴定，免疫组的12头发病或LMT阳性牛中，分别有1头牛奶样(8.33%)分离出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌;对照组29头发病或LMT阳性牛奶样中，金黄色葡萄球菌分离率为20.69%，显著高于免疫组，而大肠杆菌的分离率差异不大(表5)。表4田间试验中A牛场乳腺炎发生情况分析注：*:隐性乳房炎判定标准为体细胞>50万/mL;**:P<0.05o项目A牛场免疫组(50头)对照组(50头)临床乳房发病数(发病率％)1(2.0%)6(12.0%)隐性乳房炎发病数(发病率％)*11(22.0%)23(46.0%)7d内日平均产奶量/kg**18.52±0.5717.26±0.83表5A牛场乳房炎阳性试验牛奶样中细菌的分离鉴定注：*:临床乳房炎患病牛。细菌患乳房炎奶牛数免疫组(12)对照组(29)大肠杆菌1(8.33%)*2(6.90%)金葡菌1(8.33%)6(20.69%)*大肠杆菌和金葡菌0(0)2(6.90%)*其他细菌10(83.33%)21(72.41%)B牛场田间试验结果显示，免疫组和对照组分别有1头(3.3%)和4头(13.3%)奶牛患临床乳房炎，免疫组比对照组的发病率低10%，对临床型乳房炎的保护率为75.2%;二次免疫后第3个月时，免疫组隐性乳房炎的发病率较对照组降低26.6%，对隐性乳房炎的保护率为49.9%；统计第3个月时7d内的日平均产奶量，免疫组较对照组高1.58kg，差异显著(PM0.05)(表6)。对此期间乳房炎阳性牛奶样进行细菌分离鉴定，免疫组仅1头(11.11%)牛奶样中同时分离出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌;对照组乳房炎阳性奶样金黄色葡萄球菌分离率为26.32%，是免疫组分离率的2.5倍，大肠杆菌的分离率差异不大4头临床型乳房炎患牛奶样均分离出金黄色葡萄球菌，其中两份同时分离出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(表7)。表6田间试验中B牛场乳腺炎发生情况分析注：*:隐性乳房炎判定标准为体细胞>50万/mL;**:P<0.05o项目B牛场免疫组(30头)对照组(30头)临床乳房发病数(发病率％)1(3.3%)4(13.3%)隐性乳房炎发病数(发病率%)*8(26.7%)15(53.3%)7d内日平均产奶量/kg**22.62±0.7621.04±0.93表7B牛场乳房炎阳性试验牛奶样中细菌的分离鉴定注：a:临床乳房炎患病牛;b:其中2头为临床乳房炎患病牛。细菌患乳房炎奶牛数免疫组(9)对照组(19)大肠杆菌1(11.11%)a2(10.53%)a金葡菌1(11.11%)a5(26.32%)b大肠杆菌和金葡菌1(11.11%)a2(10.53%)a其他细菌8(88.89%)12(63.16%)3讨论奶牛乳房炎的免疫预防是当前兽医科研的难题之一，近40年来国内外兽医科研工作者一直在为此不懈努力，其中金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗一直为研究的重点和热点。目前，有关金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的实验研究包括灭活疫苗、致弱活疫苗、荚膜多糖疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、DNA与重组蛋白相结合疫苗等。近期，国外有关专家对已报道的奶牛乳房炎疫苗研发试验进行了综合评价，其中对含有荚膜多糖和类毒素疫苗给予了较高的评价［8］。本项研究所开发的金黄色葡萄球菌多价苗既包含了奶牛乳房炎病例中所分离的金黄色葡萄球菌主要外卜膜抗原CP5、CP8、336PS,也含有该类菌的主要毒素，从而保证了疫苗抗原的广泛代表性和覆盖面。国内外卜大量的研究表明，乳房炎病例中分离的金黄色葡萄球菌多为CP5、CP8和336PS型，但不同国家这3种血清型流行的比例不同。Poutrel等［9］对法国分离的212株牛源金黄色葡萄球菌血清型分型研究表明，70%属于CP5和CP8型美国对44%的奶牛场分离的金黄色葡萄球菌的血清型分型发现，CP5占51%,CP8和未能分型的分别占18%和31%［10］,但他们均未对336PS进行分型。韩国学者对107株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的血清型分型发现，336PS为流行血清型，占所鉴定菌株的46.7%,CP5和CP8型均为12.1%,CP5/336PS为17.8%,CP5/PS336为6.5%，未分型的占4.7%［11］。王登峰等［12］从美国菌种保藏中心引进相关参考菌株制备了荚膜多糖抗血清，用血清分型方法结合PCR分子分型对新疆分离的117株金黄色葡萄球菌的分型表明，CP5型菌株占20.51%,CP8型菌株5.98%,336PS型菌株62.39%，未分型菌株11.11%，表明新疆奶牛乳房炎病例中的金黄色葡萄球菌的流行血清型以336PS为主，同时含有CP5型和CP8型。用这三种血清型菌株制苗，理论上将覆盖近90%的感染菌株。乳房炎致病因素的多样性增加了乳房炎疫苗效果评价的难度。本研究采用临床攻毒实验和田间试验相结合对所研制疫苗进行了免疫效果评价。临床攻毒实验显示，该疫苗可以显著减少金黄色葡萄球菌引起的临床型乳房炎。虽然该疫苗的人工感染试验取得了较好的免疫保护效果，但田间试验才是评估疫苗实际效果的有效方法。本疫苗在两个牧场选取了160头泌乳牛开展了田间试验，结果表明该疫苗对临床型乳房炎的发病平均保护率为79.05%，对隐性乳房炎的平均保护率为51.05%，免疫牛平均产奶量提高1.26kg以上。对试验样品的微生物学分析，证实该疫苗可以降低金黄色葡萄球菌的感染率。人工感染与临床试验结果的差异主要是由于乳房炎的复杂病因和多病原所致。疫苗免疫仅仅是乳房炎预防的技术方法之一，疫苗的免疫效果与使用疫苗牛场的饲养管理水平以及圈舍卫生、挤奶程序有很大的相关性。规范的挤奶程序、性能良好的挤奶设备、干燥清洁的饲养环境、营养全面的饲料及科学饲养管理则是有效控制奶牛乳房炎的基本措施。致谢衷心感谢赛比克公司(SEPPIC)为本研究免费提供试验用疫苗油佐剂及在疫苗安全评价中提供的技术支持。参考文献：[1]WatlsJL.EtiologicAgentofBovineMastitis[J].VetMicroial,1988,(16):41-66.[2]袁永隆，张礼华，刘纯传，等.我国奶牛乳房炎常见病原菌的区系调查[J].中国农业科学，1992,25(4):70-76.潘虎，刘纯传，张礼华，等.我国部分地区奶牛乳房炎的病因及发病情况调查[J].中国兽医科技，1996,26(2):16-17.刘文进，陈创夫，膝文军，等.新疆垦区奶牛乳房炎致病菌的调查[J].家畜生态学报，2005,4(26):91-95.[5]李建军，杨学云，王治才，等.新疆集约化奶牛场隐性乳房炎流行病学和病原学研究[J].新疆农业科学，2008,2:187-191.[6]WaageS,MarkRA.BacteriaAssociatedwithClinicalMastitisinDairyHeifers[J].JDairySci,1999,82:712-719.[7]LeitnerG,LubashevskyE,GlickmanA,etal.DevelopmentofaStaphylococcusaureusVaccineagainstMastitisinDairyCows.I.ChallengeTrials[J].VetImmunolImmunopathol,2003,1(2):31-38.[8]PereiraUP,OliveiraDG,MesquitaLR,etal.EfficacyofSt