TitlePage长庚大学生物医学研究所生理暨药课件

TitlePage長庚大學生物醫學研究所生理暨藥理組博士論文探討LPS誘發氣管平滑肌細胞調控黏附分子與cytosolic

phospholipaseA2

表現的機轉Mechanismsunderlyinglipopolysaccharide-inducedexpressionofadhesionmoleculesandcytosolic

phospholipaseA2intrachealsmoothmusclecells

研究生：林維寧

(Wei-NingLin)

指導教授：楊春茂

博士

(Chuen-MaoYang,Ph.D)中華民國九十七年七月誌謝『不要爲了明天憂慮，因為明天自有明天的憂慮，一天的難處一天當就夠了。』馬太福音6:34從大二進實驗室到完成博士學位的現在，「把握今天」一直是我的目標，不用爲了明天擔憂，只要肯做就會有收穫，……在這裡先要特別感謝我的指導老師楊春茂教授，………另外，我也要感謝國防醫學院藥理研究所顏茂雄教授、台灣大學藥理研究所符文美教授、本校周美智副教授與黃聰龍副教授逾百忙之中對此論文內容的審閱與指正，並提供寶貴的意見使我的論文更趨於完善，對未來的研究方向有更多的想法。我也要謝謝實驗室裡由古至今一起打拼的同志兄弟們：…最後要感謝我的家人們:將我照顧的非常好的爸爸、媽媽、親媽、姨丈，還有陪伴長大的哥哥跟中閎，都是我非常穩固的精神後盾，因為有你們讓我一路走來無憂無慮放心自在，謝謝你們，我會永遠愛你們的。謹誌於長庚大學戊子年夏AbbreviationsAP-1:Activatingprotein-1BCECF:2’7’-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein……

PharmacologicalInhibitorsNameTargetGenisteinTyrosinekinaseD609PC-PLCU73122PI-PLCStaurosporineNon-selectiveforPKCsGF109203XNon-selectiveforPKCsRo31-8220Non-selectiveforPKCsGö-6976Ca2+-dependentPKCsPMAPKCsactivatorBAPTAIntracellularCa2+

chelatorPD98059MEK1/2U0126MEK1/2SB202190P38MAPKSP600125JNKPP1c-SrcAG1478EGFRWortmanninPI3-KLY294002PI3-KSH-5AktCurcuminp300TanshinoneAP-1HelenalinNF-BAACOCF3Analogofarachidonicacid中文摘要

(AbstractinChinese)-1呼吸道的發炎反應已被證實為呼吸系統疾病，包括：氣喘、慢性阻塞性肺疾病等的一個特殊表徵。在正常的生理環境或是病理狀態下，氣管平滑肌細胞也已被證實為神經傳導物質、發炎反應調控因數或外來物質作用的一種目標細胞(end-effectcells)。除此之外，氣管平滑肌細胞本身也是細胞激素、趨化激素、生長因數以及細胞外基質分泌的重要來源，在細胞病理狀態下的調節及結構重組中扮演重要的角色。當呼吸道發炎時，氣管會表現cytosolic

phospholipaseA2(cPLA2)及vascularcelladhesionmolecule-1(VCAM-1)等發炎性蛋白質進而調控整個發炎反應過程。再者，細胞激素及趨化激素已被證實可以調控cPLA2及VCAM-1的表現，因而調節呼吸道疾病的病程。研究調查指出，過敏原、毒害環境、病毒或細菌感染可以造成白血球細胞及淋巴細胞浸潤的現象進而導致細胞傷害或是支氣管的發炎反應。Lipopolysaccharide(LPS)已被發現存在於塵璊之中，是調控發炎反應的重要物質之ㄧ。LPS本身是格蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分，是格蘭氏陰性細菌感染引發宿主免疫反應的主要調控分子。雖然LPS已被證實可以刺激內皮細胞經由mitogen-activatedproteinkinases(MAPKs)、phosphoinositide3-kinases(PI3-K)/AKT及其他訊息傳遞因數調控cPLA2及VCAM-1表現，然而對於LPS刺激氣管平滑肌細胞表現cPLA2及VCAM-1的分子機轉仍然並未被證實。因此，本篇論文主要是探討LPS刺激氣管平滑肌細胞表現cPLA2及VCAM-1等發炎蛋白的相關分子機制。我們將會建立細胞內訊號分子以及細胞核內共同活化因數(co-activators)間的相對關係模式。我們的假設為LPS經由增加cPLA2及VCAM-1的表現量而影響氣管平滑肌細胞與白血球細胞之間的相互作用，進而促使呼吸道發炎反應的產生。為了說明這些問題，我們將一一探討細胞內的相關訊息傳遞因數，如：proteinkinaseCs（PKCs）、MAPKs、Src、proline-richtyrosinekinase(PyK2)、epidermalgrowthfactor(EGFR)、PI3-K/Akt、

nuclearfactor-κB(NF-κB)、activatorprotein-1(AP-1)和histone

acetyltransferase(HAT)等，是否參與在LPS刺激氣管平滑肌細胞引發cPLA2及VCAM-1表現的機轉當中。在本篇論文的第一個部份主要是探討LPS刺激氣管平滑肌細胞調控cPLA2表現的機轉。LPS以時間依賴性(time-dependent)的方式刺激cPLA2的表現以及PGE2的釋放，此種現象可以受到前處理genistein(tyrosinekinase抑制劑)、D609(phosphatidycholine-phospholipaseC抑制劑)、U73122(phosphatidylinositol-phospholipaseC抑制劑)、GF109203X和staurosporine(PKC抑制劑)、BAPTA/ATplusEDTA(鈣離子敖合劑)、PD98059(MEK1/2抑制劑)、SB202190(p38抑制劑)、SP600125(c-Junterminalkinase(JNK)抑制劑)、LY294002與wortmannin(PI3-K抑制劑)等抑制劑與p42或p38dominantnegativemutantstransfection所抑制。LPS刺激誘發cPLA2表現和PGE2釋放等現象也會受到前處理helenalin(NF-κB選擇性抑制劑)或是NF-Binducingkinase(NIK)、

IBkinase(IKK)-和IKK-βdominantnegativemutantstransfection等作用而減低。並且，LPS刺激也可以直接促進IκB-α分解使得NF-κB轉移到細胞核內。另外，LPS刺激cPLA2的磷酸化增加會受到PD98059、GF109203X和staurosporine等抑制劑前處理所抑制，顯示LPS可以經由p42/p44MAPK和PKC調控PLA2的活性。再者，經由AACOCF3(選擇性cPLA2抑制劑)抑制LPS所誘發的cPLA2與COX-2表現和PGE2釋放等現象證明cPLA2在此發炎反應中所扮演的角色。經由上述這些結果確認LPS刺激氣管平滑肌細胞可以經由PLC、鈣離子、PKC、tyrosinekinase、MAPKs、PI3-K和NF-κB等訊號分子調控cPLA2表現。中文摘要

(AbstractinChinese)-2在本篇論文的第二個部分主要是探討MAPKs和NF-B在LPS刺激VCAM-1表現過程中所扮演的角色。LPS以時間依賴性的方式刺激VCAM-1蛋白質及mRNA表現量增加，此項作用可被MEK1/2(U0126)、p38、JNK、NF-B等專一性抑制劑或是MEK、p42、p38等siRNA前處理的方式所抑制。經由前處理抑制劑U0126，SB202190或是MEK、p42、p38等siRNA

transfection也會減弱LPS所誘發的p42/p44MAPK和p38磷酸化作用。另外，LPS刺激也會造成IB-分解，和NF-B轉移到細胞核內。此項作用能夠受到helenalin，U0126，SB202190，SP600125等藥理性抑制劑前處理所抑制。再者，LPS刺激VCAM-1的表現量增加可以促進多型性核白血球(PMNs)黏附到人類氣管平滑肌細胞，而前處理抑制劑helenalin，U0126或SP600125則可以抑制此情形。因此，經由上述這些結果推測，在人類氣管平滑肌細胞中，LPS的刺激可以經由p42/p44MAPK，p38和

JNK調控NF-B的活性增加，進而引發VCAM-1基因的大量表現。中文摘要

(AbstractinChinese)-3

論文的第三部份主要是探討LPS是否能經由Src/EGFR/PI3-K/Akt/p300等一連串的訊息傳遞途徑調控VCAM-1基因表現。LPS刺激VCAM-1基因大量的表現所強化的嗜中性白血球黏附作用可被抑制劑LY294002和Wortmannin所抑制。LPS造成Src、PYK2、EGFR及AKT的磷酸化作用以及VCAM-1基因的表現也可被Src(PP1)、EGFR(AG1478)、PI3-K、AKT(SH-5)、p300(curcumin)等藥理性抑制劑，或是Src，AKT，p300等siRNA

以及p110shRNA

transfection前處理方式所抑制。利用免疫螢光，免疫沉澱，和ChIP(Chromatinimmunoprecipition)assay等實驗進ㄧ步發現，LPS的刺激可以造成AKT的活化作用並且轉移到細胞核內，並且與細胞核內蛋白p300以及VCAM-1promoterregion連結在一起，進而調控VCAM-1的

promoter活性促使VCAM-1mRNA表現量增加。經由以上的結果，我們發現，當LPS刺激人類氣管平滑肌細胞，可以經由transactivationpathway(Src/PYK2/EGFR)來調控AKT的磷酸化以及增強p300活性，進而導致VCAM-1的基因表現增加。中文摘要

(AbstractinChinese)-4中文摘要

(AbstractinChinese)-5在論文的最後一個部分，我們將焦點集中於AP-1是否也參與在LPS刺激VCAM-1的表現過程當中。前處理AP-1的抑制劑(tanshinone)，不管是在人類氣管平滑肌細胞或是在ICR老鼠等活體外或體內的試驗當中，都可明顯減少LPS所誘發的VCAM-1基因表現以及白血球細胞的吸附聚集現象。LPS可以刺激c-Fos的表現量增加，並且受到前處理GF109203X，Ro-318220、Gö-6976(conventionalPKCs抑制劑)、U0126和SB202190等抑制劑所抑制。另外給予GF109203X、Ro31-8220、Gö-6976、U0126、SB202190和SP600125等抑制劑，皆可以減弱LPS刺激氣管平滑肌細胞所誘發的c-Jun表現量。LPS刺激之下c-Fos和c-Jun的表現量可以進而促使AP-1promoter的活性增加。活化的AP-1會結合到VCAM-1promoterregion，導致VCAM-1promoter的活性增加，促使VCAM-1mRNA以及蛋白質的表現，進而強化人類氣管平滑肌細胞與白血球之間的黏附作用。此現象也可以藉由前處理GF109203X、Ro31-8220或Gö-6976等抑制劑而受到抑制作用。這些實驗結果說明，在人類氣管平滑肌細胞中，LPS也能夠透過活化PKCs/MAPKs/AP-1等一連串的訊息傳遞路徑來調節VCAM-1的表現。中文摘要

(AbstractinChinese)-6

本篇論文深入探討LPS在人類氣管平滑肌細胞中的作用機制，證實我們於研究開始時所設立的假設，發現LPS能夠經由增加氣管平滑肌細胞與白血球細胞之間的交互作用，進而促使發炎反應的發生，而參與整個呼吸道疾病病程的發展。希望能藉由增加對於cPLA2和VCAM-1等發炎基因調控相關訊息傳遞機轉的瞭解，發展出更適當的抗發炎的新療程。英文摘要

(AbstractinEnglish)Airwayinflammationhasbeenprovenassignificantfeaturesofairwaydiseasesincludingasthmaandchronicobstructivepulmonarydisease(COPD).Trachealsmoothmusclecells(TSMCs)functionasend-effectorcellsinvolvinginresponsetostimulationofvariousneurotransmitters,proinflammatorymediators,andexogenoussubstancesreleasedunderhomeostaticorpathologicconditions.Inaddition,TSMCsarethesourceofproinflammatorycytokines,chemokines,growthfactors,andECM,whichfurtherplayasignificantroleinregulatingcellularpathologyandstructureremodeling.Duringtheairwayinflammation,cytosolic

phospholipaseA2(cPLA2).…….TableofContents(1)Page(頁數)指導教授推薦書…………………i口試委員會審定書………………ii博士論文著作授權書……………iiiAcknowledgements(誌謝)…………ivAbbreviations(縮寫表)…………….vPharmacologicalinhibitors(藥理性抑制劑)……...viiAbstractinChinese(中文摘要)…………………...viiiAbstractinEnglish(英文摘要)……………………xiiTableofContents(目錄)…………...xviCHAPTERIINTRODUCTION……………1SECTION1.Backgroundandsignificance……2SECTION2.Specificaims………………………18SECTION3.Figuresandtables………………19CHAPTERIIMATERIALSANDMETHODS……………57SECTION1.Materials…………...58SECTION2.Methods…………60TableofContents(2)CHAPTERIII(Results)…………...69Inductionofcytosolic

phospholipaseA2bylipopolysaccharideincaninetrachealsmoothmusclecells:InvolvementofMAPKsandNF-κBpathwaysSECTION1:Background……………70SECTION2:Results………………73SECTION3:Discussion……………..79SECTION4:Figuresandlegends……………………83CHAPTERIV(Results)…….……………………..100InvolvementofMAPKsandNF-κBinLPS-inducedVCAM-1expressioninhumantrachealsmoothmusclecellsCHAPTERV(Results)..…..……………………...127LipopolysaccharideinducesVCAM-1expressionandneutrophiladhesiontohumantrachealsmoothmusclecells:InvolvementofSrc/EGFR/PI3-K/AktpathwayCHAPTERVI(Results)…………..157Lipopolysaccharideup-regulatesVCAM-1expressioninhumantrachealsmoothmusclecellsviaPKC/MAPKs/AP-1activationCHAPTERVIICONCLUSIONANDPERSPECTIVES188SECTION1:Conclusion...189SECTION2:Perspectives...192SECTION3:Schemes………………193PUBLICATIONS…………………..194REFERENCES...196SECTION1.BackgroundandsignificanceRolesofproinflammatoryproteinexpressioninairwayinflammatorydiseasesI.1-1Theimportanceofairwaysmoothmusclecellsinairwayinflammatorydiseasess

I.1-2RoleoflipopolysaccharideinairwayinflammatorydiseasessI.1-3Roleofcytosolic

phospholipaseA2inairwayinflammatorydiseasesI.1-4RoleofadhesionmoleculesinairwayinflammatorydiseasesCHAPTERIINTRODUCTIONI.1-6RolesofMAPKpathwaysinairwayinflammatorydiseasesI.1-7RoleofPI3-kinase/AktpathwaysinairwayinflammatorydiseaseI.1-8RoleofCalciuminairwayinflammatorydiseasesI.1-9RoleofPKCinairwayinflammatorydiseasesI.1-10RoleofRTKsinairwayinflammatorydiseaseI.1-11RoleofNF-BandAP-1inairwayinflammatorydiseasesI.1-12Roleofp300inairwayinflammatorydiseasesTheintracellularsignalingsofToll-likereceptors(TLRs)SECTION2.SpecificaimsTheoverallobjectiveofthisworkistoestablishthemechanismsofLPSactionontheTSMCsthatregulatestheexpressionofVCAM-1thusresultsinenhancementofcelladhesionandinflammation.Ourhypothesisofthisproposalisthatup-regulationofcPLA2andVCAM-1inducedbyLPSmaycontributetoleukocyte/TSMCsinteractionandexaggerateinflammatoryresponsesinairways.Toevaluatethehypothesis,thespecificaimsaddressedare:1.ToinvestigatetheproteinandmRNAexpressionofcPLA2andVCAM-1inducedbyLPSin

TSMCs.2.TodifferentiatethepathwaysofMAPKsandNF-BactivationinvolvedinexpressionofcPLA2andVCAM-1inducedbyLPSinTSMCs.3.ToinvestigatewhetheralternativepathwaysrelatedtoLPS-inducedcPLA2andVCAM-1expressioninTSMCs:RTKtransactivation,SrcandPI3K/Akt.4.TodetermineifCa2+orPKCisozymesactivationrelatedtoLPScorrelatedtocPLA2andVCAM-1expressioninTSMCs.5.ToconstructacPLA2andVCAM-1promoterconstructanddetecttheactivityofcPLA2andVCAM-1promoterstimulatedbyLPS.6.Toestablishtherelationshipofp300andNF-B,AP-1relatedtotheexpressionofcPLA2andVCAM-1inTSMCs.7.TodeterminethefunctionalactivityofcPLA2andVCAM-1expressedbyLPSinTSMCs.TheseresultswillprovidenewinsightsintothemechanismsofLPSaction,supportingthehypothesisthatLPSmaycontributetoleukocyte/TSMCsinteractionandpromoteinflammatoryresponsesinvolvedinthedevelopmentofairwaydiseases.IncreasedunderstandingofsignaltransductionmechanismsunderlyingcPLA2andVCAM-1generegulationwillcreateopportunitiesforthedevelopmentofanti-inflammationtherapeuticstrategies.

CHAPTERIINTRODUCTION

CHAPTERIIMATERIALSANDMETHODSSECTION1.MaterialsII.1-1ChemicalsandreagentsII.1-2AntibodiesII.1-3si-RNAs,shRNAsandplasmidsSECTION2.MethodsII.2-1IsolationofHTSMCsII.2-2AnimaltreatmentII.2-3IsolationofCTSMCsII.2-4PreparationofcellextractsandWesternblottinganalysisII.2-5TotalRNAextractionandRT-PCRanalysisII.2-6Isolationofbronchoalveolar

lavage(BAL)II.2-7PromoterluciferaseactivityassayII.2-8TransienttransfectionwithsmallinterferenceRNA,shorthairpinRNAanddominentnegativeplasmidII.2-9CellFractionisolationII.2-10ImmunofluorescencestainingII.2-11CoimmunoprecipitationAssayII.2-12ChromatinimmunoprecipitationassayII.2-13NeutrophiladhesionassayII.2-14MeasurementofPGE2levelsII.2-15Analysisofdata

SECTION1.MaterialsII.1-1.ChemicalsandReagentsII.1-2.AntibodiesII.1-3.siRNAs,shRNAsandplasmidsCHAPTERIIMATERIALSANDMETHODSSECTION2.MethodsII.2-1.IsolationofHTSMCsII.2-2.AnimaltreatmentII.2-3.IsolationofCTSMCsII.2-4.PreparationofCellExtractsandWesternBlottingAnalysisII.2-5.TotalRNAExtractionandRT-PCRAnalysisII.2-6.Isolationofbronchoalveolar

lavage(BAL)II.2-7.PromoterLuciferaseActivityAssayII.2-8.TransientTransfectionwithSmallInterferenceRNA,ShortHairpinRNAandDominent

NegativePlasmidII.2-9.CellFractionIoslationII.2-10.ImmunofluorescenceStainingII.2-11.CoimmunoprecipitationAssayII.2-12.ChromatinImmunoprecipitationAssayII.2-13.NeutrophiladhesionassayII.2-14.MeasurementofPGE2levelsII.2-13.AnalysisofDataCHAPTERIIMATERIALSANDMETHODSInductionofcytosolic

phospholipaseA2bylipopolysaccharideincaninetrachealsmoothmusclecells:InvolvementofMAPKsandNF-BpathwaysSECTION1:BackgroundSECTION2:ResultsSECTION3:DiscussionSECTION4:FiguresandlegendsThispartofthesishadbeenpublishedonCellularSignalling,2006,18:1201-1211CHAPTERIII(Results)InvolvementofMAPKsandNF-BinLPS-inducedVCAM-1expressioninhumantrachealsmoothmusclecellsSECTION1:BackgroundSECTION2:ResultsSECTION3:DiscussionSECTION4:FiguresandlegendsThispartofthesishadbeenpublishedonCellularSignalling,2007,19:1258-1267CHAPTERIV(Results)LipopolysaccharideinducesVCAM-1expressionandneutrophiladhesiontohumantrachealsmoothmusclecells:InvolvementofSrc/EGFR/PI3-K/AktpathwaySECTION1:BackgroundSECTION2:ResultsSECTION3:DiscussionSECTION4:FiguresandlegendsThispartofthesishadbeenpublishedonToxicologyandAppliedPharmacology,2008,228:256-268CHAPTERV(Results)Lipopolysaccharideup-regulatesVCAM-1expressioninhumantrachealsmoothmusclecellsviaPKC/MAPKs/AP-1activationSECTION1:BackgroundSECTION2:ResultsSECTION3:FiguresandlegendsSECTION4:DiscussionCHAPTERVI(Results)

Fig.10.LPSstimulatesVCAM-1expressionthroughPKCs/MAPKs/AP-1pathway.SECTION1:ConclusionSECTION2:PerspectivesSECTION3:SchemesCONCLUSIONANDPERSPECTIVESCHAPTERVIISECTION3:Schemes

Wang,C.C.,C.W.Lee,W.N.Lin,C.C.Lin,S.F.Luo,J.S.Wang,andC.M.Yang.Involvementofp42/p44MAPK,p38MAPK,JNKandNF-Bininterleukin-1-inducedVCAM-1expressioninhumantrachealsmoothmusclecells.Am.J.Physiol.288:L227-L237,2005.2.Luo,S.F.,W.N.Lin,C.M.Yang,C.W.Lee,C.H.Liao,Y.L.Leu,andL.D.Hsiao.Inductionofcytosolic

phospholipaseA2bylipopolysaccharideincaninetrachealsmoothmusclecells:involvementofMAPKsandNF-Bpathways.Cell.Signal.18:1201-1211,2006.3.Lee,C.W.,W.N.Lin,C.C.Lin,S.F.Luo,J.S.Wang,J.Pouyssegur,andC.M.Yang.TranscriptionalregulationofVCAM-1expressionbytumornecrosisfactor-inhumantrachealsmoothmuscle