第8章基因工程原理1

PrinciplesofGeneEngineering蓝色玫瑰当前第1页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering2009年10月20日，日本三得利公司研发的转基因蓝玫瑰第2代产品问世。当前第2页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering这种蓝玫瑰是三得利公司耗资30亿日元培育而成，他们1990年就开始开发蓝玫瑰，从蓝三叶草中提取蓝色素基因，将基因转入玫瑰花，培植出蓝玫瑰。这株玫瑰的花瓣中所含的色素为蓝色，纯度接近100%。当前第3页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering本章内容1基因工程的历史和发展2基因工程的基本内容和技术3基因工程相关酶学4基因工程中的载体和宿主系统5目的基因的获得和分离方法6外源基因导入宿主细胞7重组体的鉴定和分析8外源基因在大肠杆菌中的表达9外源基因在真核细胞中的表达10蛋白质工程11基因工程的应用和展望当前第4页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering1基因工程的历史和发展主要内容基因工程的概念和特征自然界中的基因工程基因工程简史基因工程历史上的大事转基因的安全性当前第5页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering在体外将核酸分子插入载体（病毒、质粒等）构成遗传物质的新组合，并使之参到原来没有这类分子的寄主细胞内，并使之稳定繁殖。什么叫基因工程当前第6页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering基因工程两大特征a跨越物种障碍，创造出大自然中不存在的生物类型bDNA片段在寄主体内能够稳定遗传并大量扩增.当前第7页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering遗传工程（geneticengineering）基因操作（genemanipulation）基因克隆（genecloning）分子克隆（molecularcloning）重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）…………与”基因工程”类似的表述方法当前第8页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering农杆菌侵染植物当前第9页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering基因工程是一门综合学科当前第10页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering最为关键的技术是核酸限制性内切酶和DNA连接酶的发现，它们被称为“分子剪刀”和“分子胶水”。当前第11页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering基因工程的开路先锋们PaulBergStanleyN.CohenHerbertBoyer当前第12页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering2基因工程的基本内容和技术2.1基因工程的基本内容（1）目的基因的获得（基因分离或合成）（2）重组分子的形成：将目的基因与能够自我复制并具有选择性标记的载体分子相连接而成（3）把重组DNA分子引入到合适的受体（寄主）细胞中进行扩增（4）从繁殖的大量细胞群体中筛选鉴定出含有重组DNA分子的受体细胞的克隆（5）从筛选的受体细胞克隆中提取出已扩增的目的基因后，或再克隆到表达载体上导入新的寄主细胞，以便产生人们所需要的物质；或者将已扩增的基因做进一步的分析研究之用。当前第13页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering2.2基因工程的基本技术当前第14页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering基因工程的主要操作步骤目的基因的获得基因与载体的连接重组子的转化重组子的筛选鉴定产生新物质其他研究当前第15页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering3基因工程相关酶学3.1核酸限制性内切酶3.2DNA连接酶3.3反转录酶3.4其他酶当前第16页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering基因工程中常用的部分酶举例当前第17页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering3.1核酸限制性内切酶当前第18页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering核酸限制性内切酶，又称为“分子剪刀”1968年，大肠杆菌中第一种限制性内切酶被发现，至今已经发现有几百种内切酶，其中应用与基因工程的有几十种之多。而且大部分酶的产生都是利用基因工程的方法。当前第19页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering限制性内切酶的种类和特点特性内切酶I内切酶II内切酶III组成辅助因子切割特点在基因工程中作用3种亚基ATPMg2+S-腺苷甲硫氨酸非特异性随机切割,识别位点与切割位点相差1kb没有用处单亚基Mg2+特异性切割,识别位点就是切割位点或在附近十分有用2个亚基ATPMg2+S-腺苷甲硫氨酸比较特异性的切割,识别位点在切割位点上游24-26bp处用处不大限制性内切酶II，简称限制性内切酶或内切酶当前第20页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering限制性内切酶性质（1）识别位点:长度一般4-8bp，具有回文结构特点。当前第21页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering识别位点一般具有回文结构当前第22页\共有83页\编于星期五\21点（2）切割后形成的末端特点：当前第23页\共有83页\编于星期五\21点5‘端突出当前第24页\共有83页\编于星期五\21点3‘端突出当前第25页\共有83页\编于星期五\21点平端当前第26页\共有83页\编于星期五\21点形成的粘性末端易于再连接当前第27页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering（3）内切酶的命名内切酶的名字由3个字母组成，物种属名的第一个大写字母加上种名的前2个小写字母；还可以加上菌株的第一个字母和大写的罗马字母等以示区别。如从流感嗜血杆菌d株中分离得到3个不同的限制酶，分别命名为HindI,HindII和HindIII等。当前第28页\共有83页\编于星期五\21点Haemophilusinfluenzae

d

嗜血流感杆菌d株HindIII

HindIII注意前3个字母是斜体如从流感嗜血杆菌d株中分离得到3个不同的限制酶，分别命名为HindI,HindII和HindIII等。当前第29页\共有83页\编于星期五\21点（4）同裂酶(isoschizomer):又叫“异源同工酶”，指来源不同，但识别序列一致，而切割的方式相同或不同的酶。当前第30页\共有83页\编于星期五\21点当前第31页\共有83页\编于星期五\21点当前第32页\共有83页\编于星期五\21点（5）同尾酶（isocaudamer）：来源不同，识别的靶序列也不同，但是切割后产生的末端相同的酶。当前第33页\共有83页\编于星期五\21点来源识别序列切割序列同裂酶（异源同工酶）不同相同相同或不同同尾酶不同不同相同同裂酶与同尾酶比较当前第34页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering3.2DNA连接酶1967年第一次从细菌中发现DNA连接酶(ligase)，后来从噬菌体等中也发现有连接酶存在。又被称为“分子胶水”。连接机制：催化相邻的3’-OH与5’-P之间形成磷酸二酯键。当前第35页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering常用的DNA连接酶：大肠杆菌的ligase：只能连接粘性末段，不能连接平末段；T4ligase：可以连接粘性末段或平末段。在分子生物学中的应用：用于DNA片段之间的连接。当前第36页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering3.3反转录酶(逆转录酶)（1）反转录酶的组成和性质反转录酶是一类独特的DNA聚合酶，以RNA为模板，指导DNA的合成。又称为“依赖RNA的DNA聚合酶”。1970年由Temin等首先在鸟类致病的RNA病毒中发现。由一条多肽链组成，但有多种酶的活性。当前第37页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering（2）反转录酶在基因工程中的应用反转录酶在基因工程中最主要的用途就是将RNA反转录成DNA。当前第38页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering反转录酶催化从RNA合成cDNA当前第39页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering

3.4其他酶DNA聚合酶I,反转录酶T3,T7,SP6RNA聚合酶,TaqDNA聚合酶

聚合酶

末段转移酶,T4多核苷酸激酶,碱性磷酸酶修饰酶绿豆核酸酶,核酸酶S1外切酶III,DNaseI,RNaseA,RNaseH核酸酶当前第40页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4基因工程中的载体和宿主系统4.1基因工程中载体系统

载体的概念、特征、发展历程和类型常用的载体类型及其特征4.2基因工程中的宿主系统当前第41页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4.1基因工程中载体系统4.1.1什么叫载体(vector)载体就是来源于大肠杆菌或噬菌体等的DNA,可供外源DNA插入并将外源DNA导入宿主细胞的片段。当前第42页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering由于单独的外源DNA片段不能在细胞内长期存在,所以载体的作用就是使目的DNA能够长期在细胞中存在下去。这是因为载体是一个独立于染色体外的,可以自主复制并遗传的单元。当前第43页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4.1.2作为克隆载体的基本条件a有自主复制能力（即本身是一个复制子），或整合到基因组DNA中,但仍保持独立。b有合适的可供外源基因插入的克隆位点(单克隆或多克隆位点)，外源基因的插入不影响其自主复制能力。c具备选择标记，以便对重组子进行筛选。这些标记包括对抗生素的抗性、氨基酸的合成酶、噬菌斑形成、产生色素等。当前第44页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineeringd除保留必要序列外，载体本身应尽可能的小，便于导入细胞和在细胞内生存繁殖。可以携带一定长度的外源DNA片段并有较高的拷贝数。e使用安全。可隆载体只能生长在有限的宿主细胞内，在体内不能进行重组，细胞间不能发生转移，不产生有害性状，不能离开工程宿主自由扩散。f其他特殊要求。当前第45页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4.1.3载体发展的历程载体的构建发展经历大约3个时期：（1）第一阶段：主要依赖天然存在的质粒。如Cohen最早使用的pSC101。后来对载体进行了一系列的改造，如删除非必需序列、引入标志基因、减少酶切位点等。如pBR322就是经过改造的质粒，使用非常广泛。经过改造，质粒在细菌体内的拷贝数均达到几十以上，甚至上百，上千。pBR322成为现今多种质粒的来源。当前第46页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4.1.3载体发展的历程（2）第二阶段：20世纪70年代后期至80年代中期。构建出了一大批相对分子量小、拷贝数多、有多种特殊性能的载体。以pUC系列载体著名，集中了当时载体的诸多优点。并在此基础上发展出pUC载体系列，可以满足多种需要。此外，用于酵母、昆虫、高等动植物基因工程的各种载体也得到了发展。当前第47页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering第三阶段：近期，主要是借助于一些辅助序列引进一些新的功能，如在pUC18/19质粒载体中插入丝状噬菌体M13的基因间隔区，其中含有单链复制起点，在M13辅助噬菌体帮助下，可以产生单链DNA模板，这种载体称为pUC118/119。当前第48页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4.1.4载体的类型载体的类型很多，不同的分类方法会有不同的结果。例如：可以根据DNA分子克隆的目的分为：克隆载体、穿梭载体、表达载体等；根据使用时载体的宿主细胞类型，也可以分为：原核细胞载体（大肠杆菌载体）、真核细胞（哺乳动物细胞、酵母细胞等）载体等。当前第49页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering克隆载体：是指以繁殖DNA片段为目的的载体用于外源基因的重组、克隆、复制和保存。一般分子量较小，在宿主细胞中拷贝数较高，所以外源DNA片段可以通过克隆技术大量获得。穿梭载体：是指那些即可以在原核细胞中又可以在真核细胞中繁殖的载体，因为这类载体含有两种复制起点。表达载体：可以使克隆的外源基因在宿主细胞内表达的载体。当前第50页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering1质粒载体（plasmid）质粒是一种亚细胞的有机体,结构比病毒还简单,没有蛋白质外壳,没有细胞外的生命周期,只能在寄主细胞内独立的增殖,并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。自然界中,不论是真核细胞还是原核细胞,不论是格兰氏阳性还是格兰氏阴性细菌,甚至是真菌的线粒体中也有质粒的存在。(1)质粒的一般生物学特征当前第51页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering大肠杆菌中的质粒当前第52页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering大肠杆菌中的质粒绝大部分的质粒由DNA组成，是共价闭合的环状双链分子，质粒大小从1kb到200kb不等。质粒存在于细胞质内，独立于染色体外并能自主复制（含有复制起始区），可以稳定地游离于染色体之外，一定时候又可逆地整合到染色体上，或消失；质粒可以通过转化从细菌外部进入细菌内部或在细菌之间迅速传递。当前第53页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering质粒的DNA虽然只占到染色体DNA的1-3%，但是却编码着一些非常重要的基因，赋予所在的寄主一些非染色体控制的性状。包括抗性特征、代谢特性、修饰寄主生活方式等。质粒还编码产生抗菌素基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因等几十种基因。这些基因常常赋予细菌一些非常特殊的本领。质粒DNA编码的表型当前第54页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineeringa共价闭合环形(cccDNA)：两条DNA保持完整。一般成超螺旋状态，称为SC（supercoiled）构型。b开环DNA(ocDNA)：两条链中一条完整，另一条有一个或几个缺口，称为OC构型。c线形分子(lDNA)：两条链均断裂，分子呈线形，称为L型。环形双链DNA质粒分子有3种构型当前第55页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering结合型质粒与非结合型质粒：格兰氏阴性细菌中的质粒可以分为结合型质粒与非结合型质粒。其中，结合型质粒携带除了自主复制所必需的遗传信息外还带有控制细菌结合和质粒转移的基因，所以又叫做“自主转移质粒，可以在细菌之间转移，还可以带动宿主染色体的转移。非结合型质粒则与之相反。基因工程中采用的质粒是属于非结合型质粒才能保证基因工程的安全。当前第56页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering质粒的拷贝数：标准生长条件下每条细菌染色体平均具有的质粒DNA数目叫质粒的拷贝数。严谨型复制控制的质粒在每个寄主细胞中只有1-3个拷贝，属于低拷贝质粒；松弛型复制控制的质粒在每个寄主细胞内有10-60或几百个拷贝的质粒，属于高拷贝数的质粒。质粒的严谨型和松弛型不是固定的，寄主的种类会改变质粒的类型。当前第57页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering质粒的不亲和性(incompatibility)：也叫做质粒的不相容性，指没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的质粒不能在同一个寄主细胞内稳定共存，其中有一个将被逐渐排斥(稀释)掉，这样的质粒叫做不亲和质粒。由于质粒具有不亲和性，所以我们才能在只带有一种质粒的细菌中分离得到成分单一的质粒DNA。当前第58页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering基因工程中使用的质粒载体天然质粒不能完全符合载体的要求，基因工程中使用的质粒载体都是经过改造的。但不管怎样，作为载体的质粒都必须含有以下几个元件：复制基因(确保插入的外源基因可以复制)选择标记(抗性标记或生长要求标记)克隆位点(单克隆或多克隆位点)当前第59页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineeringpBR3224361bppBR322质粒是1977年Bolivar利用天然质粒改造而来的。长度为4361bppBR322特点复制起点:保证细胞中质粒的拷贝数维持在10-20个拷贝/细胞抗性基因2个:抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因克隆位点:单一的酶切位点,供外源基因插入分子较小:有利于质粒进入细胞中和方便DNA操作。当前第60页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering高拷贝数的质粒载体

便于获得大量的克隆的基因产物,例如从ColE1和pMB1衍生而来的载体.低拷贝数的质粒载体

在一些情况下,当想将外源基因产物的量控制在一定水平而避免对寄主细胞造成伤害.如pSC101,pLG338,pLG339,pHSG415等质粒载体.当前第61页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering当前第62页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering当前第63页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering能够使克隆在其中的外源基因在细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的克隆载体叫做表达载体。表达载体当前第64页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering表达载体必须具备的条件(1)有强的启动子,可以为宿主的RNA聚合酶识别.(2)有强的终止作用;(3)受控的启动子(可诱导型等).(4)起始密码子ATG与SD序列的距离要适当,便于翻译.(5)具有复制起点;(6)具有多克隆位点,便于外源基因插入,具有选择性标记等。当前第65页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering表达载体要件当前第66页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering2噬菌体载体（phagevector）λ噬菌体是一种目前研究最为透彻的大肠杆菌的双链DNA噬菌体，大小为50kb左右，实验发现其中有1/3左右的DNA序列不是病毒繁殖所必须的,这一段DNA序列可以用其他DNA序列取代，经过点突变、基因组置换等改造，而发展成λ噬菌体载体。λ噬菌体载体当前第67页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering特点：(1)可以容纳比质粒更大的外源DNA，理论上可以克隆的外源基因大小为23kb（实际只有15kb左右）；(2)噬菌体转染宿主细胞的效率比质粒转化细菌高2-3个数量级。当前第68页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering单链DNA噬菌体载体亲源关系很近的大肠杆菌噬菌体M13、f1和fd都含有单链环状DNA，长度是6400bp。M13进入细菌后，其中的单链DNA起模板作用，形成双链的复制型DNA（RFDNA）。不引起宿主菌的裂解。宿主菌通过一种非溶菌的方式将噬菌体挤出去，每个细胞每个世代可以释放大约1000个左右的子代噬菌体。当前第69页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering将M13噬菌体的双链的复制型DNA（RFDNA）改造，可以形成单链DNA噬菌体载体。可以容纳外源基因大小在1500bp左右。由于这种M13噬菌体可以生产单链DNA，所以M13载体在基因工程中用于单链探针的制备、DNA的单链测序和定位诱变等。近年来发展起来的噬菌体表面展示技术主要使用的就是M13噬菌体载体。当前第70页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering噬菌粒载体由单链噬菌体载体和质粒载体结合而成的新型载体,叫做噬菌粒(phagemidorphasmid)。可以产生单链DNA也可以产生双链DNA，载体分子量小，克隆能力大，使用非常广泛。如pUC118和pUC119噬菌粒载体(pUC+M13).pBluescript噬菌粒载体(又叫做pKS/pSK),可以用做体外转录载体使用，用途也十分的广泛，几乎世界上每一个分子生物学实验室都在使用。当前第71页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering3酵母载体酵母是基因工程中使用非常广泛的真核单细胞生物，其中使用的载体一般可以分为三类：3.1质粒载体3.2整合载体3.3酵母人工染色体当前第72页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineeringa酵母附加型质粒载体（YEP）：来源于野生质粒，大小6300bp，长度约为2µm，又叫做2µm质粒。是双链环状DNA，有一段长度为599bp的反向重复序列而分为两个部分，各有基因的启动子和控制元件。YEP是在2µm质粒基础上加上酵母核DNA和细菌质粒pMB9部分序列改造而成的。3.1质粒载体当前第73页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineeringc酵母着丝粒质粒（YCP）：为了克服酵母复制质粒YRP传代不稳定的缺点而构建了YCP质粒。但是这种质粒对宿主有毒性，只能以低拷贝数存在。b酵母复制质粒（YRP）：由大肠杆菌质粒pBR322加上酵母染色体的自主复制序列而成，高拷贝，不稳定，转化效率高，但是多代培养后，拷贝数减少。当前第74页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering3.2整合载体整合载体（intergratingvector,YIP）是指不含有酵母的自主复制序列，不能在酵母中独立复制，必须在载体整合到酵母染色体上之后才能使其中的基因得到表达。3.3酵母人工染色体利用酵母载体产生的酵母人工染色体克隆系统可以克隆非常大的DNA片段，从而代替噬菌体载体合cos质粒载体，克隆外源DNA的能力可以达到1000-2000kb（1-2Mb），详见下文。当前第75页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering4植物基因克隆载体目前用于植物基因转移中所用的载体主要是植物病毒和其他一些病原体，还有一些细菌携带的特殊质粒。植物基因转移的病毒载体单链RNA植物病毒（如烟草脆裂病毒TRV，雀麦草花叶病毒BMV）单链DNA植物病毒（如番茄金色花叶病毒TGMV）双链DNA植物病毒（如花椰菜花叶病毒CaMV），使用较多植物基因工程的质粒载体来自土壤农杆菌中的Ti质粒，可以将外源基因转入单子叶和双子叶植物中。当前第76页\共有83页\编于星期五\21点PrinciplesofGeneEngineering5动物基因克隆载体哺乳动物细胞病毒载体人工构建的哺乳动物细胞载体应该具备的条件是：（1）含有大肠杆菌复制子和抗性标记；同时含有真核细胞选择标记；（2）含有哺乳动物细胞