第3章植物组织培养与细胞

3.3植物组织与器官培养3.3.1植物组织培养的定义与分类3.3.2重要概念3.3.3细胞分化和形态建成3.3.4植物组织培养的基本步骤3.3.5植物组织器官培养3.3.6植物组织培养的应用3.3.7人工种子3.3.8植物组织与器官的生物反应器培养3.3.9植物组织与器官培养存在的问题当前第1页\共有109页\编于星期五\20点3.3.1植物组织培养的定义与分类1.定义

植物组织培养(planttissueculture)是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。其理论基础是细胞的全能性。

当前第2页\共有109页\编于星期五\20点2.分类根据外植体种类的不同，组织培养可分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。根据培养方法的不同，组织培养可分为：微室培养、平板培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等。根据培养的功能性的不同，组织培养可分为：再生体系、离体受精、突变体选择、体细胞杂交等。当前第3页\共有109页\编于星期五\20点3.3.2重要概念全能细胞（totipotentcell)

愈伤组织(callus)

外植体(explantation)

继代培养(secondaryculture)

胚胎培养(embryoculture)

脱分化（dedifferentiation）再分化（redifferentiation)

茎尖培养无性繁殖系(clone)

器官发生（organogenesis)

胚状体（embryoid)当前第4页\共有109页\编于星期五\20点全能细胞（totipotentcell)：能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同生物体。

愈伤组织(callus)：在离体培养过程中由外植体组织增生的细胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞。外植体(explant)：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料，可以是器官、组织和原生质体等。继代培养(secondaryculture)：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。当前第5页\共有109页\编于星期五\20点胚胎培养(embryoculture):包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房(未授粉或已授粉的)培养，可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素；用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂种，因此它也是研究生殖生理的有用方法；胚乳培养是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系，以及获得三倍体植株的一个手段。脱分化（dedifferentiation）:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。再分化（redifferentiation):脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。当前第6页\共有109页\编于星期五\20点茎尖培养:较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养。通常用1—10mm大小的外植体来加速植物的无性系繁殖。

无性繁殖系(clone)：由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代。器官发生（organogenesis)：在组织培养中或悬浮培养中，由培养物到显示有自然的器官形成，如形成芽或根的现象。

胚状体（embryoid)：在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。当前第7页\共有109页\编于星期五\20点3.3.3植物细胞分化和形态建成一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个步骤：

(1)培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织；

(2)有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后又由其分化成不同的器官原基（如根原基、叶原基等）。当前第8页\共有109页\编于星期五\20点脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式：（1）器官发生方式：其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成，具有单极性结构。（2）胚胎发生方式：在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，它们类似于合子胚，具有双极性结构。魔芋胚状体当前第9页\共有109页\编于星期五\20点通过胚状体途径产生再生植株有3个显著优点：（1）在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽数目多；（2）胚状体形成的速度快；（3）胚状体结构完整，一旦形成，一般都可以直接萌发形成小植株，因此成苗率高。当前第10页\共有109页\编于星期五\20点3.3.4植物组织培养的基本步骤以胡萝卜为例，介绍植物组织培养的一般过程（图解）：（1）培养材料的采集（2）培养材料的消毒（3）制备外植体（4)接种和培养（5）组培苗的练苗和移栽当前第11页\共有109页\编于星期五\20点花药培养单倍体细胞和胚状体细胞和集合体悬浮培养球形形成胚状体心形期鱼雷期子叶期外植体外植体在培养中直接振荡在培养液中振荡在生长素-营养物琼脂培养基上生长的愈伤组织植物组织培养的一般过程的完整周期图解当前第12页\共有109页\编于星期五\20点（1）培养材料的采集组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。

对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴。草本植物多采集茎尖。

在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。

当前第13页\共有109页\编于星期五\20点（2）培养材料的消毒先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

在无菌坏境中将材料放入70％酒精中浸泡30－60秒。

再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水中消毒10分钟。

取出后用无菌水冲洗三、四次。

当前第14页\共有109页\编于星期五\20点（3）制备外植体

将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。

当前第15页\共有109页\编于星期五\20点（4)接种和培养

接种：

在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种4－10个。

封口：

接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

温度：

培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

增殖：

外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。

根的诱导：

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得健壮根系。

当前第16页\共有109页\编于星期五\20点（5）组培苗的练苗和移栽试管苗从无菌以及光照、温度、湿度稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。当前第17页\共有109页\编于星期五\20点这是哪个阶段？这是哪个阶段？植物组织培养流程图当前第18页\共有109页\编于星期五\20点3.3.5植物组织器官培养

1.定义

植物组织器官培养就是在植物细胞全能性理论指导下，在组织以及器官水平上开展研究的，其目的是实现植物细胞的全能性以完成植物生命周期的过程。当前第19页\共有109页\编于星期五\20点2.愈伤组织诱导（1)愈伤组织形成特点

由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过3个步骤：

启动期（或诱导期）

分裂期

分化期当前第20页\共有109页\编于星期五\20点启动期（或诱导期）:是成熟组织在各种刺激因素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程。受激作用后分裂前细胞的主要变化有：一是呼吸作用加强，消耗氧量明显增加；二是多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前RNA的含量可增加300%；三是蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋白质的总量增加200%；四是各种与分裂有关的酶活性大大加强。当前第21页\共有109页\编于星期五\20点分裂期：其主要特征是：细胞数目增加很大，结构疏松，缺少有组织特征的结构，一般呈现透明状或浅颜色。分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化，出现了形态和生理功能上的分化，直至出现了分生组织的瘤状结构及维管组织。此时，细胞体积不再减小，呈现的颜色多种多样。当前第22页\共有109页\编于星期五\20点（2）愈伤组织的生长及分化当前第23页\共有109页\编于星期五\20点（3）影响愈伤组织培养的主要因素

外植体:虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的潜在能力，但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的难易程度差别很大。

基本培养基：众多的培养基基本上都可以诱导出愈伤组织，但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形成愈伤组织的难易程度不同，对培养基的反应也有差别。激素组合：通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和增殖。其中，2,4-D是诱导愈伤组织最有效的物质。当前第24页\共有109页\编于星期五\20点3.举例以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术：

番杏别名洋菠菜，属番杏科番杏属的多年生草本植物。主要以肥厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用，并可全株入药，有凉血、解毒、利尿、消疮疥等的功效。具体方法如下：（1）材料和培养基：番杏果实和幼苗；(1）芽分化培养基：MS+6-BA1.0mg/L（单位下同）+NAA0.1+3.0%蔗糖;(2）诱导愈伤组织与分化培养基：MS+6-BA1.0+2,4-D0.5+3.0%蔗糖;(3）生根培养基：3/4MS+NAA0.1+1.5%蔗糖;(4）继代培养基：MS培养基。以上各培养基加0.7%琼脂，PH5.8。（2）培养条件：培养温度25℃左右，日光灯照明，每天光照10h,光照强度1000~1500lx。当前第25页\共有109页\编于星期五\20点（3）无菌苗的获取：将番杏果实在浓硫酸中浸泡约1h，流水冲洗30min。再在超净工作台（图示）内用70%乙醇浸泡2-3min，在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干，再用0.1%升汞浸泡10min,无菌水冲洗3-4次,用无菌手术刀轻轻刮去果实被腐蚀的部分，然后将其接种于培养基（3）中，培养1周后种子长出无菌苗（图示）。（4）愈伤组织培养：切取0.5cm长的不带腋芽的茎段，置于（2）号培养基上。3周后，茎段周围出现白色松脆的愈伤组织（图示）。愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。当前第26页\共有109页\编于星期五\20点超净工作台番杏无菌苗番杏愈伤组织当前第27页\共有109页\编于星期五\20点（5）继代培养：将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出，用无菌水洗净，以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并用无菌水反复冲洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止。用解剖刀将愈伤块切成数小块，在接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的1个番杏茎段组织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养。（6）分化培养：剥离白色松脆的愈伤组织继续置于（2）号培养基上，2月后，部分白色愈伤组织上出现绿色芽点（图示）。随着时间推移，绿色芽点不断膨大，其中部分形成正常绿苗（图示）。当前第28页\共有109页\编于星期五\20点带绿色芽点的愈伤组织番杏分化绿苗番杏盆栽苗番杏无菌苗当前第29页\共有109页\编于星期五\20点（7）生根培养：剥离绿苗接种到（3）号培养基上诱导生根（图示）。7d后开始陆续出根，3周后可有多条须根形成，生根率达95.7%。（8）炼苗与移栽：移栽前，敞瓶炼苗3-4d，取出洗净后，栽至装有蛭石的塑料杯中，加自来水，杯上罩上玻璃烧杯保湿，4d后昼覆夜敞，2周后可除掉玻璃杯。3周后，试管苗张出新根，再将其移入蛭石与土（2：1）的盆（图示）中。成活率为83.3%。当前第30页\共有109页\编于星期五\20点3.3.6植物组织培养的应用1.无性系快速繁殖技术2.获得无病毒植株3.新品种培育4.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用5.种质资源的保存6.产业化生产前景

当前第31页\共有109页\编于星期五\20点1.无性系快速繁殖技术对那些繁殖系数低或很难用种子繁殖的名特珍品种的繁殖实用意义更大,甚至是无可取代。如脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖,以比常规育苗方法快数百倍到数万倍的速度扩大繁殖,及时提供大量优质种苗。如野生珍稀兰花属国家二级以上保护植物,野生兰花的组织培养利于保护这些珍稀的植物资源。目前,在国内外已掀起“试管苗”热,如国外在兰花、杜鹃、月季、草莓、苹果、柑桔、石竹、铁线莲、桉树等进行快速繁殖已达到商品化生产;我国近年来已获成功推广的有甘蔗、葡萄、罗汉果、兰花、银杏、水稻、甘蔗、菠萝、香蕉、草莓、月季、菊花、无籽西瓜、栎树、山楂、猕猴桃、雪松等品种。试管苗在国际国内市场上已形成产业化生产,如广西都安县山葡萄苗、罗城县毛葡萄苗均由国内组织培养公司提供,每年需要量达数十万株。当前第32页\共有109页\编于星期五\20点2.获得无病毒植株很多农作物都带有病毒,病毒是植物的严重病害,至2000年,已定名或暂定名的植物病毒的种类已达909种,极难防治。如防治无方,不仅会影响作物的品质及产量,严重的只能拔除病株,造成很大经济损失。病毒在植株上的分布是不均一的,病毒是通过维管系统及胞间连丝移动的,老的组织和器官病毒含量高,幼嫩未成熟的组织和器官病毒含量较低,如分裂速度很快的茎尖、根尖生长点几乎不含病毒。用植物生长点培养法可获得无病毒植株,恢复植物的优良品质,达到复壮的目的。目前已在广西荔蒲芋、永福罗汉果、桉树、马铃薯、甘薯、百合、兰花、大蒜、石竹、柑桔、草莓等植物品种上得到成功推广。当前第33页\共有109页\编于星期五\20点3.新品种培育单倍体育种:通过花药培养,从小孢子获得单倍体植株,染色体加倍后获得正常二倍体植株,这是一条育种的新途径。单倍体育种可以缩短育种年限,节约人力物力,较快地获得优良品种,目前已有40多种植物获得了单倍体植株。我国在水稻、小麦、烟草、柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上,处于领先地位。胚培培养、子房培养、胚珠培养:为了克服植物远缘杂交的不亲和性,可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段使胚正常发育并成功地培养出杂交后代。现在已在棉花、玉米、黄麻等品种上获得成功。当前第34页\共有109页\编于星期五\20点4.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调控等。分离单个基因，对它DNA进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。

当前第35页\共有109页\编于星期五\20点5.种质资源的保存传统上,种质是以种子的形式保存的。这种保存方法的局限性:

(1)

种子生活力随贮存时间的延长生活力逐渐下降,并常受到病虫害的侵袭;(2)

难以保存无性繁殖的作物。另一方面,如用苗圃或田间大量保存各种植物基因型,成本极高,还存在天灾毁灭的危险。在低温条件下(-20℃--196℃),在试管中保存组织培养物质的方法保存种质,具有传统方法不可比拟的优点:

(1)

只需要较少的空间就能保存大量的“营养体种子”(vegetativeseeds);(2)

不受病虫害侵染;(3)

当需要的时候,可把所贮存的材料用作核心原种迅速繁殖出大量植株;(4)

由于不带已知的病毒和病原菌,因此可以把这些植物的克隆在国际间进行交换;(5)

节省大量人力、财力、物力。经低温贮藏的物种,保持了稳定的遗传性和良好的存活率。据报导,冷冻保存的胡萝卜胚状体,在保存了1年之后仍有再生成植株的能力。当前第36页\共有109页\编于星期五\20点6.产业化生产前景

植物有用化合物包括药物、蛋白质、脂肪、糖类、橡胶、香精油、色素等。这些化合物许多都是高等植物的次生代谢物,有些化合物还不能大规模地人工合成,而靠植物产生这些化合物产量有限。因此,利用组织培养方法,培养植物的某些器官或愈伤组织,并筛选出高产、高合成能力、生长快的细胞株系,以进行工业化生产植物有用化合物,是一条行之有效的途径。近年来,南京药学院丁家宜利用组织培养生产出人参干粉。这是我国第一个用组织培养进行医药的工业化生产的例子。当前第37页\共有109页\编于星期五\20点总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力也远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。当前第38页\共有109页\编于星期五\20点思考题1.愈伤组织的形态发生有哪两种情况?并比较各自由此形成完整植株的不同。2.请以某种植物为例来论述其无菌苗的诱导、继代快繁、生根培养及其驯化移栽过程。3.植物组织培养的主要意义有哪些？最新进展如何？当前第39页\共有109页\编于星期五\20点3.3.7人工种子1.定义人工种子（artificialseed)是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。1978年，由著名的植物学家Murashige最早提出人工种子概念。人工种子当前第40页\共有109页\编于星期五\20点2.人工种子的优点（1）可根据不同植物的要求配制，如可加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分等，这样获得的人工种子就优越于天然种子，生产效率高；（2）可以固定杂交优势，加速良种繁育；（3）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；（4）可保存珍贵品种。当前第41页\共有109页\编于星期五\20点选取目标植物从适合的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移至无激素培养体细胞胚包裹人工种皮温室（大棚）播种获取目标植物3.人工种子制作及培养流程图示当前第42页\共有109页\编于星期五\20点4.人工种子制作的关键环节（1）制备大量的高质量体细胞胚是人工种子制作的前提。（2）体细胞胚胎发生的同步化控制。（3）选择合理的包埋技术。当前第43页\共有109页\编于星期五\20点

所谓高质量的体细胞胚，指的是体细胞胚具有发育成完整小植株的能力，这就要求体细胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双极性结构，这是人工种子制作能否成功的关键所在。当前第44页\共有109页\编于星期五\20点人工种子的制作要求胚状体的形态上大小一致，发育进程上相似，这样制成的人工种子其活力强，萌发率高。

如何对体细胞胚胎发生进行同步化控制和纯化筛选呢？（1）化学抑制法（2）低温抑制法（3）渗透压选择法（4）机械过筛选择法（5）应用植物胚性细胞分级仪当前第45页\共有109页\编于星期五\20点化学抑制法：在细胞培养初期加入抑制DNA合成的药物，使细胞DNA合成暂时停止，当除去DNA抑制剂时，细胞开始进入同步分裂。低温抑制法：采用低温处理导致发育停滞，形成所谓的温度冲击，处理时间过后，恢复正常温度，可以使胚性细胞达到同步分裂的目的。当前第46页\共有109页\编于星期五\20点I.人造种皮

要求：能保持胚状体的活力，利于萌发或贮藏。如海藻酸钠、明胶、树胶、琼脂糖、淀粉及动物胶等。II.

人造胚乳人工胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质等营养物质。III.包埋技术滴注法装模法当前第47页\共有109页\编于星期五\20点滴注法当前第48页\共有109页\编于星期五\20点5.人工种子的研究现状及应用前景美国加州的植物遗传公司率先申请了胡萝卜等多种植物的人工种子的研究专利。瑞士、法国的一些大公司集中研究开发蔬菜芽人工种子和胚芽生产。欧洲多个国家联合攻关的尤利卡计划中，把人工种子的研制作为生物技术研究的重点项目。我国在胡萝卜、芹菜、黄连、苜蓿等植物的人工种子的开发应用上也获得了阶段性成果。

正因为人工种子在生产和科学研究中具有重要意义，所以国内外都非常重视该领域的研究。人工种子的产生是对植物传统繁殖方式的革命。当前第49页\共有109页\编于星期五\20点3.3.8植物组织与器官的生物反应器培养生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代谢产物走向工业化和产业化的关键技术。与适用于微生物、植物细胞培养的生物反应器不同，适合植物组织或器官培养的生物反应器系统具有其特殊性，如需考虑植物组织或器官的附着，以及有固定块状培养物带来的营养吸收、气体传递等问题。利用高度分化的植物器官、组织培养以提高目的产物含量的研究也日益引起人们的重视。根、芽、体细胞胚以及冠瘿组织等的培养研究都有一定发展。当前第50页\共有109页\编于星期五\20点以刘春朝等人采用生物反应器培养青篙毛状根生产青篙素为例来介绍生物反应器的植物组织与器官培养技术及其应用。

青篙素为世界卫生组织(WHO)推荐的治疗恶性疟疾(如脑型疟疾和抗氯喹性疟疾)的特效药，具有速效，低毒等特点。另外，青篙素还有免疫促进作用和抗病毒作用，可开发抗病毒和抗艾滋病药物。世界上青篙素原料主要来源我国和越南，由于天然青篙素受气候，季节，虫害等限制。每年青蒿素的产量远远不能满足市场需求，因此供不应求。当前第51页\共有109页\编于星期五\20点121151091414135231647一体化设计的雾化生物反应器（培养青篙毛状根生产青篙素）1生物反应器2中心筒3不锈钢筛网4空气出口5时间继电器6雾化头7培养液8空气入口9空气过滤器10流量计11电磁阀12空气储罐13雾化装置1440w日光灯8当前第52页\共有109页\编于星期五\20点雾化反应器当前第53页\共有109页\编于星期五\20点3.3.10植物组织与器官培养存在的问题1.

研究中的问题对于植物全能性表达和激素作用机制等尚未开展深入研究，而且对于培养比较困难的植物缺乏研究。2.

技术上的问题效率偏低、操作比较繁琐、培养结果比较难以确定等技术问题还需解决。3.

可应用性范围目前有许多植物还未培养成功，许多有意义的杂交亲本或组合还不能培养成功，或不能有效培养成功。4.

生物反应器技术（1）适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制。（2）提高生物反应器技术内部培养物生长的均匀性和空间利用率。（3）培养物接种、取样、无菌化等操作技术的优化。（4）不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制。（5）生物反应器培养的放大技术。当前第54页\共有109页\编于星期五\20点3.4植物细胞培养3.4.1定义3.4.2植物细胞培养的方法3.4.3植物细胞培养的培养基3.4.4植物单细胞培养3.4.5植物细胞培养的意义3.4.6植物细胞的生物反应器大规模培养（自学）3.4.7植物细胞两相培养技术（自学）3.4.8植物细胞的生物反应器固定化培养（自学）3.4.9植物细胞培养存在的问题与发展趋势当前第55页\共有109页\编于星期五\20点3.4.1定义植物细胞培养（plantcellculture)是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养集中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。植物细胞培养的理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部能力（全能性）。当前第56页\共有109页\编于星期五\20点3.4.2植物细胞培养的方法

根据培养对象，植物细胞培养主要有单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养等。

根据培养系统分为悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等。

植物细胞培养系统分类（图示）。当前第57页\共有109页\编于星期五\20点细胞培养固体培养液体培养琼脂培养固定化培养摇瓶悬浮培养反应器大规模培养分批培养半连续培养连续培养恒化培养恒浊培养植物细胞培养系统分类当前第58页\共有109页\编于星期五\20点3.4.3植物细胞培养的培养基培养基（culturemedium）是植物细胞培养中最主要的部分，除了培养材料本身的因素外，培养基的种类成分等直接影响培养材料的生长发育，应根据培养材料的种类和培养部位选取适宜的培养基。当前第59页\共有109页\编于星期五\20点培养基的主要成分水无机成分有机成分无机大量元素：在培养基中含量超过100mg/L的无机元素，包括N,P,K,Ca,Mg,S等。无机微量元素：在培养基中含量低于100mg/L的无机元素，包括Fe,Mn,B,Zn,Cu,Mo,Co,Cl。糖维生素肌醇氨基酸及有机添加物植物生长调节物质琼脂当前第60页\共有109页\编于星期五\20点3.4.4植物单细胞培养

单细胞培养（singlecellculture）是从不同植物中获得单细胞无性系进行细胞杂交及研究细胞的分裂、分化、生长及发育的重要方法，并为大规模培养奠定基础。分离的单细胞看护培养微室培养平板培养悬浮培养单细胞无性系当前第61页\共有109页\编于星期五\20点1.单细胞制备方法：愈伤组织或悬浮培养物(常);用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离（1）机械法（2）酶解法（3）愈伤组织诱导法当前第62页\共有109页\编于星期五\20点由组织器官经愈伤组织分离单细胞步骤：1）诱导产生愈伤组织；2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；茎段当前第63页\共有109页\编于星期五\20点悬浮振荡培养3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。当前第64页\共有109页\编于星期五\20点2.单细胞培养方法

（Singlecellculture）当前第65页\共有109页\编于星期五\20点单细胞培养常用的方法：单细胞培养方法看护培养法微室培养法固体平板培养法液体浅层培养法当前第66页\共有109页\编于星期五\20点（1）看护培养法（Nurseculture）用途：诱导形成单细胞系。含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织a.看护培养的含义及用途当前第67页\共有109页\编于星期五\20点（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。（2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm²）已灭菌的滤纸，放置一晚上。（3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。（4）恒温培养。b.看护培养基本技术当前第68页\共有109页\编于星期五\20点优点：

（1）简便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺点：

（1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。c.看护培养特点：当前第69页\共有109页\编于星期五\20点a.微室培养的含义及用途用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。（2）微室培养法（Microculture）第一节单细胞培养含义:将单细胞培养在少量的培养基中。当前第70页\共有109页\编于星期五\20点微室培养图示：1滴含单细胞培养液周围加石蜡油凹穴载玻片旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中26~28℃恒温培养当前第71页\共有109页\编于星期五\20点b.微室培养特点：优点：

（1）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程

缺点：

（1）培养时间较短当前第72页\共有109页\编于星期五\20点（3）平板培养法（PlanteCulture）a.含义及用途：含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。当前第73页\共有109页\编于星期五\20点培养基植物叶片单细胞平板可采用哪些方法？固体平板培养图示：当前第74页\共有109页\编于星期五\20点b.特点优点：

（1）可以定点观察；

（2）分离单细胞系容易；

缺点：

（1）培养细胞气体交换不畅。当前第75页\共有109页\编于星期五\20点(1)、悬浮细胞密度的调制

平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10³-100×10³个/ml。c.平板培养的基本技术初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度当前第76页\共有109页\编于星期五\20点1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7%琼脂条件培养基。条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。（2）培养基配制当前第77页\共有109页\编于星期五\20点植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。

(4)培养：26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35℃）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。当前第78页\共有109页\编于星期五\20点（4）双层滤纸植板培养法当前第79页\共有109页\编于星期五\20点（5）细胞悬浮培养（Suspensionculture）特点

1）细胞营养吸收、环境条件好，细胞增殖快,形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养当前第80页\共有109页\编于星期五\20点悬浮培养类型和方法成批培养连续培养当前第81页\共有109页\编于星期五\20点a.成批培养/分批培养（Batchculture）含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。当前第82页\共有109页\编于星期五\20点成批培养特点

（1）培养基体积固定；

（2）必须适当搅拌；

（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长；

（4）但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。当前第83页\共有109页\编于星期五\20点培养时间培养细胞数目12345延迟期对数生长期直线生长期缓慢期静止期12345细胞生长曲线当前第84页\共有109页\编于星期五\20点成批培养的方法(1)旋转培养(2)往返震荡培养(3)旋转震荡培养(4)搅动培养当前第85页\共有109页\编于星期五\20点b.连续培养（Continuousculture）含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。当前第86页\共有109页\编于星期五\20点连续培养的特点：（1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应；

（2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；

（3）适于大规模工业化生产当前第87页\共有109页\编于星期五\20点(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液(2)连续培养：

封闭式和开放式连续培养的种类：Productionofanthocyanin当前第88页\共有109页\编于星期五\20点加入培养基排出培养基及其培养物连续培养图示：当前第89页\共有109页\编于星期五\20点1、条件培养基2、细胞密度(>临界密度)3、生长激素4、pH5、CO23.影响单细胞培养的因子当前第90页\共有109页\编于星期五\20点4.细胞的保存（1）继代培养保存法

悬浮培养的细胞每隔1-2周换液进行继代培养。如高等植物细胞、海藻等的细胞。（2）低温保存法

一般选择5-10℃的温度下培养，每隔10天换液。（3）冰冻保存法

1）低温保存

-20℃左右保存细胞。

2）超低温保存

液氮保存。温度达到-196℃。效果最理想。当前第91页\共有109页\编于星期五\20点3.4.5植物细胞培养的意义目前利用植物细胞培养技术生产植物产品已成为工业化生产植物产品的一条有效途径。随着植物细胞悬浮培养技术的发展，单细胞培养的成功，加之各种新型生物反应器的问世，使得植物细胞有可能象微生物那样在发酵罐中大量连续培养。因此在人为条件下大规模培养这些植物细胞具有极大的经济吸引力。当前第92页\共有109页\编于星期五\20点与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点包括：（1）代谢产物的生产是在控制条件下进行的，因此可以通过选择优良细胞系和优化培养条件等方法得到超越整株植物产量的代谢产物。不仅节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域的限制。（2）细胞培养是在无菌条件下进行的，因此可以排出病菌和害虫的影响。（3）可以通过特定的生物转化途径获得均一的有效成分。（4）可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。当前第93页\共有109页\编于星期五\20点总之，利用植物细胞培养进行有用物质生产不受时间、环境等条件限制，而且快速、高效。植物细胞培养用于具有生理活性的次生代谢产物的生产方面现已成为继微生物发酵技术以后当代生物技术的一个重要应用技术。当前第94页\共有109页\编于星期五\20点思考题1.如何制作人工种子？制作过程中要注意哪些关键环节？2.与天然种子相比，人工种子有哪些优缺点？3.植物细胞培养的营养成分主要包括哪些？分别起什么作用？4.植物单细胞培养有哪些方法？指出每一种培养方法的要点。当前第95页\共有109页\编于星期五\20点3.5植物原生质体培养3.5.1原生质体3.5.2原生质体的制备3.5.3原生质体培养3.5.4原生质体的发育和植株再生3.5.5应用举例当前第96页\共有109页\编于星期五\20点3.5.1原生质体1.定义