生物芯片分类及应用

一、

概念、分类及应用1当前第1页\共有73页\编于星期四\19点（一）、两个概念生物芯片

主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片技术是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。2当前第2页\共有73页\编于星期四\19点微阵列芯片（Microarray）微型实验室芯片(Lab-on-a-chip)液体芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分类及应用3当前第3页\共有73页\编于星期四\19点Lab-on-a-chip微型实验室芯片是通过在芯片上刻成微流路径从而将涉及生物检测的主要步骤—样品准备/生化反应/结果检测—整合在一张芯片上。4当前第4页\共有73页\编于星期四\19点5当前第5页\共有73页\编于星期四\19点6当前第6页\共有73页\编于星期四\19点LiquichipBead,Capturemolecule,Analyte,Reportermolecule是构成liquichip的4个主要部分。Bead上带有两种荧光，根据这两种荧光的比例可以将bead分为多种。目前已有48种，正在开发中。Capturemolecule:作用相当于探针，能特异性的与被检测物结合。Analyte:样品中被检测的成分。Reportermolecule:带有荧光的报告分子，能特异性的与被检测物结合。7当前第7页\共有73页\编于星期四\19点Liquichip反应的一般步骤：1.先将capturemolecule结合在bead上，2.将这种标记了的bead与样品反应。Capturemolecule可以与相应的analyte特异性的结合，3.此时再加入荧光标记的，特异结合analyte的reportermolecule。4.检测：用liquichipworkstation进行检测。原理是同时对bead和reportermolecule上的荧光进行检测。从而确定被结合的analyte的种类和数量。

8当前第8页\共有73页\编于星期四\19点Liquichip技术特点描述1．基于bead的这种固相反应技术，具有灵敏度高、信号强度高、灵活性好、所需样品量少的特点。2．与传统的蛋白芯片相比，有两大优势，反应速度更快，灵活性更好。3．由于检测方法的特点，在大部分的实验过程中，都不需要洗脱步骤，省时，且不会破坏反应的动态平衡。4．有配套的蛋白表达和纯化体系。（his-tag）

9当前第9页\共有73页\编于星期四\19点Lquichip应用领域：蛋白质定量蛋白质功能研究蛋白表达谱分析。

蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受体-配基分析、蛋白质核酸相互作用分析分析。

10当前第10页\共有73页\编于星期四\19点微阵列芯片蛋白芯片基因芯片

11当前第11页\共有73页\编于星期四\19点蛋白芯片(ProteinChips)高通量微阵列蛋白分析方法利用抗体抗原结合原理，采用化学发光或荧光检测

标记抗体或抗原，来检测抗原或抗体。12当前第12页\共有73页\编于星期四\19点蛋白芯片应用免疫学分析

蛋白与蛋白之间相互作用

DNA与蛋白质分子相互作用13当前第13页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片基因芯片是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。14当前第14页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray15当前第15页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片

按内涵划分：

cDNA芯片

Oligo芯片:25mer(affymetrix),70mer(Operon)，80mer（Clontech）,

按功能划分：

基因组芯片：

检测某一基因是否存在，若存在，拷贝数是多少。探针是DNA.

表达谱芯片：确定基因表达的途径与表达产物。探针是RNA或cDNA

测序芯片：通过探针与微阵列的配对分析获得探针的序列结果。16当前第16页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片应用基因表达检测多态性分析遗传图谱定位基因分型通过杂交反应测定序列17当前第17页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片应用领域遗传疾病研究癌症家系遗传疾病普通基因突变疾病感染性疾病药物筛选动物植物遗传筛选育种

个人基因身份证环境监测18当前第18页\共有73页\编于星期四\19点（三）、生物芯片应用优势高通量平行分析样品自动化程度高省时省力所需样品试剂少保护环境成本低19当前第19页\共有73页\编于星期四\19点生物芯片应用优势生物信息数据累积为生物信息公共数据库添加更多数据有利于研究基因序列与生物表型之间的关系有助于理解疾病发生的机制20当前第20页\共有73页\编于星期四\19点二、生物芯片制作技术介绍21当前第21页\共有73页\编于星期四\19点生物芯片制作方法分类22当前第22页\共有73页\编于星期四\19点

原位合成

(InSituSynthesis)化学合成原子印章原位光刻合成23当前第23页\共有73页\编于星期四\19点原位光刻合成美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。24当前第24页\共有73页\编于星期四\19点

原位光刻合成原理Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.25当前第25页\共有73页\编于星期四\19点预先合成后点样

(off-chipsynthesis)接触式点样非接触式点样26当前第26页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片点样的方式接触式点样---适合于DNA芯片的制作即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上27当前第27页\共有73页\编于星期四\19点接触式点样Best!28当前第28页\共有73页\编于星期四\19点ArrayItChipMakerPins带有细槽的不锈钢针尖载样能力:200to600nL点样体积:250pLto2.5nL(pinsize)点样直径:100µmto500µm(pinsize)DippingofpinforsamplepickupTouchingofslidewithpintoleavespotControlprintvolumewithpinsize29当前第29页\共有73页\编于星期四\19点StealthandChipmakerPin(TeleChem)30当前第30页\共有73页\编于星期四\19点Chipmaker点样技术31当前第31页\共有73页\编于星期四\19点StealthPins32当前第32页\共有73页\编于星期四\19点CatalogNumberSpotDiameter(μm)Uptakevolume(μl)DeliveryVolume(nl)Minimumspotspacing(μm)Maximumsubgridperpin(spots)Density(spots/cm2)MaximumnumberOfspots(18mm×72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,40033当前第33页\共有73页\编于星期四\19点TeleChem公司点样针技术不断发展的专利针技术共有30种针供选择与斯坦福大学共同发展专利pin,带样稳定，样品利用率高单次带样可连续点样达200--1500次特殊不锈钢材料，适用于各种溶液实际点样直径75--250um,可根据不同样品选择相应pin相当容易更换pin和pinhead以适应不同需要34当前第34页\共有73页\编于星期四\19点基因芯片点样的方式非接触式点样---适合于蛋白芯片的制作

它是以电磁阀或压电原理将样品直接喷至固相支持物表面35当前第35页\共有73页\编于星期四\19点非接触式喷点技术ThermalSolenoid螺线管PiezoelectricDP36当前第36页\共有73页\编于星期四\19点Synquad：通过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来精确控制滴液

Piezoelectric：用压电晶体将液体从孔中喷出的压电技术，两个压电晶体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。

DP37当前第37页\共有73页\编于星期四\19点非接触式点样：

synQUADTechnology38当前第38页\共有73页\编于星期四\19点ŒAspirateandPrintforMakingArrays39当前第39页\共有73页\编于星期四\19点CharacteristicsofsynQUADTechnologyWidedispenserangeLownanolitertohighmicroliterExcellentlinearityPreciseandaccurateCV’stypicallylessthan10%Precisionlessthan5%Non-contactdispensemechanismEasiermechanicalalignment(384,1536,…)“On-the-fly”printingpossibleCapableofdispensingontomembranesorslidesMultipleliquidhandlingmodesAspirate/DispenseContinuousReagentDispensing40当前第40页\共有73页\编于星期四\19点synQUADvsPiezoelectricPrintingsynQUAD/nQUADPatentedbyCartesianUsescommerciallyavailablecomponentsRobustandreliabledeliverymechanismLownanolitertolowmicroliterdispensevolumemaximumdensity:200to400spots/cm2PiezoelectricAbbottholdskeypatentsontechnologyDispensesusceptibletoairbubblesMid-picoliterdispensevolume~2500spots/cm241当前第41页\共有73页\编于星期四\19点三、

生物芯片检测系统CCD扫描仪

非共聚焦激光扫描仪激光共聚焦扫描仪42当前第42页\共有73页\编于星期四\19点数值孔径与采光效率NA0.3NA0.8NA=sin(),whereisthe½angleofthecone43当前第43页\共有73页\编于星期四\19点激光共聚焦（聚焦）Thefluorescencesourceisattheobjectivelens’focusLightgoesthroughthepinholetothedetector44当前第44页\共有73页\编于星期四\19点激光共聚焦（非聚焦）Fluorescencesourcebelowfocus(e.g.outoffocus)Outoffocuslightismostlyblockedatthepinhole45当前第45页\共有73页\编于星期四\19点ConfocalArtifactRejection

NoPinholeWithPinholeDustartifactsreducedbyatleastafactorof1046当前第46页\共有73页\编于星期四\19点CCDCameraSystemsAdvantages:FewmovingpartsFastscanningofbrightsamplesDisadvantages:NAlimitedtoabout0.40:LessappropriatefordimsamplesOpticalscattercanlimitperformanceNeedto“stitch”togetherlargeimagesConfocalLaserScannersAdvantagesSmalldepthoffocusreducesartifactshighlightcollectionefficiency.PMTdetectorshavethehighestsensitivityinthevisiblerange47当前第47页\共有73页\编于星期四\19点DNAscopeLM+

激光共聚焦芯片扫描仪48当前第48页\共有73页\编于星期四\19点xxyzxMACROscope®Filters49当前第49页\共有73页\编于星期四\19点HowtheScanSystemWorksF-thetaTelecentricScanSystemSampleScanningMirrorLaserScanLensBAC50当前第50页\共有73页\编于星期四\19点HowtoscanawholesampleHomeSensorScanningMirrorSampleLaserScanLens51当前第51页\共有73页\编于星期四\19点DNAscopeLM+优点

共聚焦面积宽:20mm70mm可以扫描多种介质(ImagesbothGlassSlideMicroarraysandCLONDIAGATtubes)背景噪声低，信噪比高全自动成像，分析结果Smallfootprint(W20cmxL30cmxH20cm)52当前第52页\共有73页\编于星期四\19点

ImagingArraysBothDry&WetDryPBSbufferCy3Cy5Cy3andCy5labeledproteindottedonglasssubstrateandimagedat5micronresolutioninbothdryandwetformats53当前第53页\共有73页\编于星期四\19点Tube1Tube2Cy3ImagesoftwoClondiagArrayTubes54当前第54页\共有73页\编于星期四\19点四、

生物芯片技术思路的比较55当前第55页\共有73页\编于星期四\19点ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip20nor80n<2,000n>50,000n sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis56当前第56页\共有73页\编于星期四\19点cDNA芯片的缺点由于不同的基因长短不同，Tm值各异，成千上万的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一。同一个体中总是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物种存在基因重叠序列的相互干扰，使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制，结果的准确性也受到影响。有些组织中在DNA双链中的无意义链中存在重叠的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表达方式很难用cDNA芯片来区分。PCR产物是结合稳定的DNA双链，加入探针后在杂交中必然存在竞争性抑制，影响探针和模板的结合能力和稳定性，进一步影响cDNA芯片的分辨能力和结果的可信度，这对于低丰度的基因影响尤为明显。PCR产物浓度不均一也可能导致错误的结论。

57当前第57页\共有73页\编于星期四\19点寡核苷酸芯片比cDNA芯片的优点

探针序列经过系统优化，减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；减少二级结构及其对杂交结果的影响

杂交温度均一，提高杂交效率

；合成产物浓度均一，避免因样品浓度差异而造成点样量差异；可以设计检测不同剪切方式的基因；

无需扩增，防止扩增失败影响实验。58当前第58页\共有73页\编于星期四\19点预合成后点样系统的综合成本

－cDNA芯片方法/步骤

试剂/仪器（万）

人员（人）

耗时（月）

构建或购买基因文库

1-31-2

3-6

PCR引物设计与合成55-65万

（2000个片段）1

3PCR产物纯化及定量1.2/20

（2000个片段1

2点样

点样仪60万

1

3天

杂交

0.3万试剂1

2扫描

扫描仪60万

1

1-2合计

197.5

–209.56-7

11-15

59当前第59页\共有73页\编于星期四\19点预合成后点样系统的综合成本

－自己合成寡聚核苷酸芯片方法/步骤试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）寡聚核苷酸的筛选及合成(2000个基因)200（每个基因用1个70碱基的寡核苷酸片段代替，合成1个碱基14元人民币计）。1(寡核苷酸片段的筛选，还需专业的软件)3-4个月，如购置DNA合成仪，成本？，但时间较长点样点样仪60万11个月

杂交0.3万试剂12个月扫描扫描仪60万11-2个月总计320.3万47-960当前第60页\共有73页\编于星期四\19点预合成后点样系统的综合成本

－应用Operon探针寡聚核苷酸芯片方法/步骤试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）探针100点样60（点样仪）1

1

杂交0.3（试剂）1

2扫描60（扫描仪）1

1-2总计220.334-561当前第61页\共有73页\编于星期四\19点Affymetrix技术平台综合成本芯片２０万杂交６小时洗涤４小时扫描４分钟合计220万１〈１２小时62当前第62页\共有73页\编于星期四\19点总结采用Affymetrix公司的生物芯片系统平台比较适合于实力雄厚的科研实验室，可以在最短的时间内尽快获得精确可靠的并且可能是前人未曾获得的实验结果，并可在国际权威杂志上获发表，尽快在相关研究领域在国际领域占领一席之地。

63当前第63页\共有73页\编于星期四\19点总结采用合成后点样的生物芯片平台比较适合于目标定位于研发、生产的实验室及生物公司。虽然购买芯片点样扫描系统的经费看起来比购买Affymetrix系统的费用要低，研发的方向可以结合实验室的研究特点，比较灵活，但前期研究需要投入较大的人力、物力和时间，综合成本并不低，而且获得的芯片信息量小，可靠性较低，使用该系统生产的芯片为材料进行的研究一般为验证性工作，且因为材料的可靠性低，很难在国际权威杂志上获得认可。目前开发生产的生物芯片尚无获得医疗许可的产品。64当前第64页\共有73页\编于星期四\19点五、

生物芯片制作所需耗材65当前第65页\共有73页\编于星期四\19点

MicroarrayingAccessories（芯片配件）PinsandPrintheadsOmniGridSlidesandReagentsOmniGridEpoxy(环氧基修饰)OmniGridAmine(氨基修饰)OmniGridAldehyde(醛基修饰)CompletelineofassociatedreagentsHybridizationChambersHybChamber™Hyb