王莹微生物遗传与变异

微生物遗传与变异生命科学与技术学院微生物教研室王莹当前第1页\共有141页\编于星期四\19点种瓜得瓜，种豆得豆。遗传性（heredity）：指生物的亲代特性在子代中重现的现象。遗传和变异是生命的本质特性之一。变异性（variation）：亲代与子代之间、子代不同个体之间生物学特性的差异性。一母生九子，九子各不同。当前第2页\共有141页\编于星期四\19点基因型（genotype）：生物的全部遗传因子或基因。表型（phenotype）：具有一定基因型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。（基因）突变（mutation）：指遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸序列发生了稳定的可遗传的变化，从而导致了生物性状的改变。表型饰变（modification）：是指微生物在生活条件发生改变时，发生暂时的形态、生理等特性的改变。橘生于淮南为橘，生于淮北则为枳。当前第3页\共有141页\编于星期四\19点微生物是现代遗传学研究最重要的实验对象1.微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。2.很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。3.对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。没有微生物遗传学的发展就没有现代分子生物学！当前第4页\共有141页\编于星期四\19点第一节遗传变异的物质基础三个经典实验转化实验T2噬菌体感染实验噬菌体重建实验一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验当前第5页\共有141页\编于星期四\19点（一）转化实验（transformation）1928年，F.Griffith首先发现转化现象。1944年，O.Avery等人在离体条件下重复了这一实验。O.Avery,1877～1955当前第6页\共有141页\编于星期四\19点肺炎双球菌转化实验肺炎链球菌R型S型当前第7页\共有141页\编于星期四\19点肺炎双球菌转化实验1944年，Avery等人在离体条件下重复了这一实验。当前第8页\共有141页\编于星期四\19点分析：S型细菌的DNA能将肺炎链球菌的R型转化为S型。而DNA纯度越高，转化效率也越高，只取纯DNA的6Χ10-8的量时，仍有转化能力。这说明，S型菌株转移给R型菌株的是以DNA为基础的遗传因子。当前第9页\共有141页\编于星期四\19点(二)T2噬菌体感染实验当前第10页\共有141页\编于星期四\19点结果说明：只有DNA才具有T2噬菌体的全部遗传信息，是噬菌体的遗传物质。当噬菌体DNA进入宿主细胞后，宿主细胞就按噬菌体DNA提供的遗传信息，在体内合成属于噬菌体的DNA和外壳蛋白，并装配成完整的噬菌体。

当前第11页\共有141页\编于星期四\19点分别提取获得烟草花叶病毒（TMV）及霍氏车前草花叶病毒（HRV）蛋白质外壳和核酸（RNA）。抗血清处理证明杂合病毒的蛋白质外壳来自TMV，而非HRV杂合病毒的后代的蛋白质外壳表现为HRV，而非TMV。遗传物质是核酸而非蛋白质植物病毒重建实验（1956年，fraenkel-Conrat）当前第12页\共有141页\编于星期四\19点DNA—主要的遗传物质综上所述注：DNA不是唯一的遗传物质，较少的微生物也靠RNA进行遗传。当前第13页\共有141页\编于星期四\19点（一）核物质——染色体染色体（chromosome）：遗传物质的载体，在细胞分裂期的存在形式，细胞分裂间期表现为染色质（chromatin）。基因组（genome）：一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。原核生物染色体：一般不具备染色体的真正形态，为叙述方便（和真核细胞比较），故名。多为单倍体。真核微生物染色体：多条染色体，例如啤酒酵母有16条染色体。有时为双倍体。二、遗传物质在微生物中的存在形式当前第14页\共有141页\编于星期四\19点1.原核生物（细菌、古生菌）的遗传物质当前第15页\共有141页\编于星期四\19点1.原核生物（细菌、古生菌）的遗传物质①染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数，如大肠杆菌DNA长约4.1×106bp，长约1100微米，含有5000多个基因。②基因组上遗传信息具有连续性；一般不含内含子（intron），遗传信息是连续的而不是中断的。当前第16页\共有141页\编于星期四\19点③功能相关的结构基因组成操纵子结构。微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。④结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；⑤基因组的重复序列少而短。古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统（复制、转录和翻译）则与细菌不同而类似于真核生物当前第17页\共有141页\编于星期四\19点2.真核微生物（如啤酒酵母）的染色体特点①典型的真核染色体结构；②基因组没有明显的操纵子结构；啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。③基因有间隔区（即非编码区）和内含子序列；④DNA重复序列多。当前第18页\共有141页\编于星期四\19点2.真核微生物（如啤酒酵母）的染色体

构成方式：①真核染色体的基本结构是核小体；②核小体排列成串珠状染色质纤丝（10nm）；核小体是由约200bpDNA（2nm）和5种组蛋白构成的。③染色质纤丝在形成30nm的螺线管（solennoid）；④螺线管组成伸展的大环状结构（300nm）；⑤大环状结构构成复杂的染色质形态。从核小体到染色体DNA被压缩了将近30万倍。当前第19页\共有141页\编于星期四\19点真核生物细胞中的DNA中只有不到5％的DNA用于所需蛋白质的基因表达，其余的DNA起“结构”作用或“调节”作用。DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状DNA分子，它以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈1.8周，形成串珠状的染色质，被串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈6个核小体、直径30nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。真核生物的染色体结构

FromBIOLOGYbyJackCCareyetal.,eds当前第20页\共有141页\编于星期四\19点当前第21页\共有141页\编于星期四\19点当前第22页\共有141页\编于星期四\19点当前第23页\共有141页\编于星期四\19点（二）核外物质——质粒质粒(plasmid)又称为附加体(episome)，指细菌细胞内、染色体外、能自主复制的遗传物质。既可以游离于细胞质中，也可以整合到宿主细胞染色体上，随染色体复制而复制。

1.质粒的基本特性（1）质粒一般是闭合、环状、双链（covalentlyclosedcircle,ccc）DNA分子，以超螺旋形式存在于细胞质中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb，细菌质粒多在10kb以内。当前第24页\共有141页\编于星期四\19点当前第25页\共有141页\编于星期四\19点cccDNAocDNALDNA当前第26页\共有141页\编于星期四\19点1.质粒的基本特性

（2）能自主复制，一般采用滚环复制方式；根据拷贝数的多少将质粒分为严紧型质粒（stringentplasmid）和松弛型质粒（relaxedplasmid）（3）不相容和相容性；两种不同类型的质粒若能稳定地共存于一个宿主细胞内，这种现象称为质粒的相容性。（4）质粒携带的基因非细胞生存所必需；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。当前第27页\共有141页\编于星期四\19点（5）可自发消除（curing）；

质粒能自从宿主细胞自发消除。某些理化因素，如高温、紫外线及吖啶类物质，可大大提高质粒的消除频率。（6）质粒可以从一个细菌转移到另一个细菌。根据其转移方式，一般把质粒分为2类：一类是接合型质粒（conjugative），可通过两个菌细胞的直接接合而主动转移如F因子。另一类是非接合型质粒（nonconjugative），必须通过噬菌体转导才能转移质粒DNA，如青霉素酶质粒。当前第28页\共有141页\编于星期四\19点2.医药方面的重要质粒当前第29页\共有141页\编于星期四\19点（1）致育因子（Fertilityfactor，F因子）又称F质粒，其大小约94.5kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。F因子能以游离状态（F＋）和以与染色体相结合的状态（Hfr）存在于细胞中，所以又称之为附加体（episome）。携带F质粒的菌株称为F＋菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F－菌株（相当于雌性）。

2.医药方面的重要质粒当前第30页\共有141页\编于星期四\19点当前第31页\共有141页\编于星期四\19点当前第32页\共有141页\编于星期四\19点（2）抗性因子（Resistancefactor，R因子）

抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R100质粒可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：

汞（mercuricion,mer）四环素（tetracycline,tet）链霉素（Streptomycin,Str）磺胺（Sulfonamide,Su）氯霉素（Chlorampenicol,Cm）

2.医药方面的重要质粒当前第33页\共有141页\编于星期四\19点当前第34页\共有141页\编于星期四\19点当前第35页\共有141页\编于星期四\19点当前第36页\共有141页\编于星期四\19点（三）转座因子（transposableelement）

转座因子：又称跳跃基因（jumpinggene）,是位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，该过程即转座（transposition）。转座因子由BarbaraMiClintock1957在玉米中发现，1983年因此获得Nobel奖。当前第37页\共有141页\编于星期四\19点1.原核生物的转座因子（1）插入序列（insertionsequence，IS）

最简单的转座单位，大小750~1600bp左右，只含编码转座必需的转座酶基因，分布于细菌的染色体DNA、质粒及噬菌体DNA上。当前第38页\共有141页\编于星期四\19点当前第39页\共有141页\编于星期四\19点1.原核生物的转座因子（2）转座子（transposon，Tn）

比IS大，其末端其实往往是两个IS。携带有特定的基因如抗生素抗性基因、重金属抗性基因或者其它基因。当前第40页\共有141页\编于星期四\19点当前第41页\共有141页\编于星期四\19点（3）转座噬菌体（transposonalphage）以大肠杆菌为宿主的温和性噬菌体，其基因组上含有噬菌体生长必需的基因和转座必需的基因，全长约39kb。当前第42页\共有141页\编于星期四\19点2.转座的遗传学效应①引起插入突变；②插入位置上出现新的基因；③少数核苷酸对的重复；⑤转座因子的切离（excision），造成回复突变。④染色体畸变；当前第43页\共有141页\编于星期四\19点三、微生物遗传物质的复制原核生物染色体的复制原核微生物只有一个复制子（replicon），采用半保留的方式进行复制，因为复制的中间产物类似希腊字母θ，故名θ复制。2.

真核生物染色体的复制真核微生物有多个复制子，以半保留的方式同时进行复制，复制的中间产物是多个复制叉（replicationfork）。当前第44页\共有141页\编于星期四\19点当前第45页\共有141页\编于星期四\19点当前第46页\共有141页\编于星期四\19点当前第47页\共有141页\编于星期四\19点3、病毒基因组的复制病毒的复制方式多种多样，除了θ复制，还有滚环复制（rollingcycle，σ复制）等方式。当前第48页\共有141页\编于星期四\19点当前第49页\共有141页\编于星期四\19点第二节基因突变一、基因和性状基因是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。（一）基因的概念和基因符号基因符号常以该基因功能特性的英文词的前3个字母表示（小写），一般用斜体，该基因的功能特性在右上角以＋/－、r/s表示。如：组氨酸基因用his（histidine的前3个字母）表示，his－表示组氨酸缺陷型。链霉素（streptomycin）有抗药性或敏感性分别写作strr或strs。当前第50页\共有141页\编于星期四\19点（二）性状和表型、基因组和基因型性状是构成生物个体所有方面的特征的总称，侧重“全部”。表型是指生物的某个基因在特定条件下表现出的特性，侧重“单个”。基因组是生物单倍体细胞所有基因的总称。侧重“全部碱基对序列的组成”；基因型是生物基因体现的功能、特性。侧重“某个基因”。当前第51页\共有141页\编于星期四\19点基本概念：生物体遗传物质的核苷酸序列发生了稳定的可遗传的变化。突变（mutation）、点突变（pointmutation）（一对或几对置换、缺失或插入）；自发突变（spontaneousmutation）、诱变（inducedmutation）；突变率（mutationrate）；正向突变（mutation）、回复突变（backmutation）；野生型（wildtype）、原养型（prototroph）；突变株（mutant）、回复突变株（reverant）。二、基因突变当前第52页\共有141页\编于星期四\19点表型饰变环境的改变，导致表型的差异。特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。基因突变遗传物质的改变，导致表型的改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为。自发突变频率通常为10－6～10－9。内因是决定因素，外因是条件。当前第53页\共有141页\编于星期四\19点1.自发性和不对应性；2.稀有性：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6～10-9；3.诱发性：某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生；4.独立性：某个基因的突变是一独立事件，对其他基因的突变几率没有影响；5.稳定性和可遗传性；6.回复性。（一）基因突变的规律当前第54页\共有141页\编于星期四\19点（二）突变自发性的实验证明三个经典实验——1.变量实验（fluctuationanalysis）（细菌遗传学的诞生）SalvadorLuria&MaxDelbrück（1943）2.涂布实验（NewcombeExperiment）Newcombe（1949）3.影印平板实验（replicaplating）JoshuaLederberg&EstherLederberg（1952）当前第55页\共有141页\编于星期四\19点变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuria&MaxDelbrück（1943）噬菌体T1在这里仅起着淘汰原始的未突变菌株和甄别抗噬菌体突变型的作用。当前第56页\共有141页\编于星期四\19点变量试验(fluctuationtest)

实验要点用E.coliT1噬菌体设计了试验实验结果来自甲管的50皿中,各皿间抗性菌落数相差极大而来自乙管的则各皿数目基本相同实验说明E.coli抗噬菌体性状的产生，并非由噬菌体T1诱导出来的，而是在它接触T1前，在某次分裂过程中自发产生的.当前第57页\共有141页\编于星期四\19点当前第58页\共有141页\编于星期四\19点涂布试验（Newcombeexperiment)

实验要点噬菌体对固体平板上的E.coli的影响实验结果Ａ组共有抗性菌落28个B组共有抗性菌落353个实验说明突变与噬菌体无关涂布使抗性菌株均匀分布抗性突变可在任何时间发生当前第59页\共有141页\编于星期四\19点当前第60页\共有141页\编于星期四\19点影印实验（replicaplating)

实验要点使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法实验结果可在根本未接触链霉素的情况下,筛选出大量的抗链霉素的菌株实验说明微生物的抗药性突变是自发产生,与相应的环境因素毫不相关

当前第61页\共有141页\编于星期四\19点（三）基因突变的类型突变的类型很多，从实用的目的出发，按突变后极少数突变株的表型是否能在选择性培养基上加以鉴别来区分。

选择性突变株（selectivemutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。

非选择性突变株（non-selectivemutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的唯一方法是检查大量菌落并找出差异。当前第62页\共有141页\编于星期四\19点（三）基因突变的类型当前第63页\共有141页\编于星期四\19点营养缺陷型（auxotroph）微生物经突变后，失去对某种生长因子（包括氨基酸、维生素、碱基等）的合成能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段。判断的标准在基本培养基（minimalmedium，MM）上不能生长，在完全培养基（completemedium，CM）上能够生长。（三）基因突变的类型当前第64页\共有141页\编于星期四\19点营养缺陷型（auxotroph）影印平板法是Lederberg夫妇在1952年建立，常用于营养缺陷型的鉴别、分离。当前第65页\共有141页\编于星期四\19点当前第66页\共有141页\编于星期四\19点生物化学统一性法则人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95％的致癌物质对微生物有诱变作用，90％以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。诱变剂的共性原则突变株的应用——Ames试验当前第67页\共有141页\编于星期四\19点美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验。具体方法：检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphmurium）组氨酸营养缺陷型菌株（his-）的回复突变率。当前第68页\共有141页\编于星期四\19点当前第69页\共有141页\编于星期四\19点当前第70页\共有141页\编于星期四\19点作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；作为aa、维生素、碱基的测定菌株。营养缺陷型的其他应用当前第71页\共有141页\编于星期四\19点证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，在60-70年代十分流行。但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，采用Ames试验发现这种物质具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。如果能在药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。药品开发过程中，必须有三致实验的数据，才能够获得批准。当前第72页\共有141页\编于星期四\19点

能抵抗有害理化因素的突变类型，根据其抵抗对象的不同可分为抗药性、抗紫外线和抗噬菌体等突变型。特点正选择标记。突变株可直接从抗性平板上获得——在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长，所以很容易分离得到。表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性。2.抗性突变型（resistantmutant）当前第73页\共有141页\编于星期四\19点

在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变（temperaturesensitive，Ts），这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25～30℃）下得到这种突变。特点负选择标记。这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因。3.条件致死突变型（conditionallethalmutant）当前第74页\共有141页\编于星期四\19点造成形态（个体、菌落形态）改变的突变型。特点非选择性突变。突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。4.形态突变型（morphologicalmutant）当前第75页\共有141页\编于星期四\19点５．抗原突变型（antigenicmutant）由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型，如细胞壁缺陷变异、荚膜变异等。６．产量突变型通过基因突变而获得的在有用代谢产物产量上高于原始菌株的变异株，也称高产突变株（highproducingmutant）。产量性状是多因子决定，突变机制较复杂。产量突变株又可分为正变株和负变株。当前第76页\共有141页\编于星期四\19点（一）自发突变的机制1.低剂量诱变因素的长期综合效应三、突变的分子机制2.碱基结构的变化一般情况下：A＝T；G≡C但T（酮式）变为T（烯醇式），则T＝G当前第77页\共有141页\编于星期四\19点CH当前第78页\共有141页\编于星期四\19点当前第79页\共有141页\编于星期四\19点3.环出效应（looping-outerrors）当前第80页\共有141页\编于星期四\19点当前第81页\共有141页\编于星期四\19点1、化学诱变剂引起的突变（1）碱基置换亚硝酸的诱变机制是使碱基发生氧化脱氨，使腺嘌呤A变成次黄嘌呤H，胞嘧啶C变成尿嘧啶U。HNO2互变异构复制（二）诱变机制当前第82页\共有141页\编于星期四\19点当前第83页\共有141页\编于星期四\19点①腺嘌呤经氧化脱氨后变成酮式次黄嘌呤（H）。②DNA双链第一次复制，结果H因在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶C配对。③DNA双链第二次复制，其中胞嘧啶（C）正常与鸟嘌呤（G）配对，使A-T→G-C，从而实现转换。④当胞嘧啶被氧化成尿嘧啶（U）时，也可实现G-C→A-T。当前第84页\共有141页\编于星期四\19点当前第85页\共有141页\编于星期四\19点碱基类似物引起的间接置换（5-BU，5-AU，8-NG）5-BU是T的结构类似物，一般以酮式状态存在于DNA中，可正常的与A配对，有时以烯醇式状态存在于DNA中，当DNA进行复制时，就只能与G配对，G再正常的与C配对，就完成A-T转换成G-C。当前第86页\共有141页\编于星期四\19点当前第87页\共有141页\编于星期四\19点当前第88页\共有141页\编于星期四\19点（2）移码突变（frame-shiftmutation）

一种诱变剂引起DNA分子中一个或几个核苷酸的增加或缺失，从而造成突变点以后的全部遗传密码的转录和翻译都发生错误，如原黄素、吖啶黄等吖啶类染料。当前第89页\共有141页\编于星期四\19点吖叮类染料的诱变机制当前第90页\共有141页\编于星期四\19点当前第91页\共有141页\编于星期四\19点2.物理诱变剂引起的诱变诱变因素（紫外线、X射线、γ射线等）诱变机制（以紫外线为例）链间或者单链上相邻的2个T分子之间胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基的正常配对，从而引起突变或死亡。3.生物诱变剂插入序列（IS）、转座子（Tn）、Mu-噬菌体当前第92页\共有141页\编于星期四\19点四、损伤的修复(p197)：酶的作用（一）光复活作用（photoreactivation）（二）切除修复（excisionrepair）（三）重组修复（recombinationrepair）（四）SOS修复（SOSrepair）当前第93页\共有141页\编于星期四\19点第三节基因的转移和重组

基因重组（generecombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移在一起重新组合，形成新的遗传个体方式。微生物细胞或作为基因供体向其他微生物细胞提供基因，或作为基因受体接受其他微生物细胞提供的基因。整合到受体细胞的染色体或质粒上并表达，使受体细胞具有新的性状。这种基因的转移、交换、重组是生物得以进化的动力。当前第94页\共有141页\编于星期四\19点1.转化（transformation）：

游离DNA分子+感受态细胞2.接合（conjugation）：

细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）3.转导（transduction）：由噬菌体介导4.原生质体融合两种菌除去细胞壁、细胞膜，人工融合细菌的三种水平基因转移形式——当前第95页\共有141页\编于星期四\19点转化受体菌（recipient,receptor）接受供体菌（donor）裸露的DNA片段，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。转化子转化成功的菌株成为转化子（transformant）受体菌转化基因的接受者recipient/receptor供体菌转化基因的提供者donor转化因子起转化作用的DNA片段一、转化（transformation）当前第96页\共有141页\编于星期四\19点1.对于供体菌：外源DNA为双链DNA；有相对高的分子量，一般在106～108。2.供体菌和受体菌间有一定的亲缘关系：同源性。

3.对于受体菌：必须处于感受态(competence)。感受态是受体菌最易接受外源DNA片断并进行转化的生理状态；处于感受态的细胞，其吸收DNA的能力，有时可比一般细胞大100倍；感受态的出现受该菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件等的影响。（一）转化的条件当前第97页\共有141页\编于星期四\19点感受态细胞的制备从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。↓以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中↓37℃振荡培养2～3h↓将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min↓4000rpm，离心10min回收细胞↓倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽↓用冰冷的0.1mol/LCaCl21mL，悬浮沉淀↓立即放在冰上保温30min↓4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞↓用冰冷的0.1mol/LCaCl20.1mL悬浮细胞（务必放冰上）↓分装细胞，每100μl一份。此细胞为感受态细胞。当前第98页\共有141页\编于星期四\19点自然遗传转化（naturalgenetictransformation）：自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制。2.人工转化（artificialtransformation）：人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。3.原生质体转化：将DNA和聚乙二醇（PEG）一同加入原生质体，或用电穿孔等方法将DNA导入原生质体。根据细菌出现感受态的形式，可以将转化分为三种类型：当前第99页\共有141页\编于星期四\19点用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔（electroporation）等是常用的人工转化手段。当前第100页\共有141页\编于星期四\19点每一个转化因子的分子量一般在106～108Da，平均约含15个基因。每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。转化的频率一般只有0.1%～1％。质粒形式的转化因子的转化率最高。当前第101页\共有141页\编于星期四\19点（1）吸附—双链DNA与感受态细胞表面受体结合（数分钟）。（2）吸收—转化DNA双链的一条链被核酸酶降解，另一条链进入细胞。低浓度溶菌酶可提高细胞壁的通透性，从而提高转化率。（3）重组—供体菌单链DNA片段→受体菌染色体组的同源区段配对→受体菌原相应单链被切除→整合、取代、连链（DNA连接酶）→杂合DNA区段→复制→重组子（4）DNA复制与细胞分裂→供体菌部分遗传性状延续。同源区段配对复制与分离（三）转化的过程当前第102页\共有141页\编于星期四\19点当前第103页\共有141页\编于星期四\19点当前第104页\共有141页\编于星期四\19点当前第105页\共有141页\编于星期四\19点当前第106页\共有141页\编于星期四\19点通过供体菌的性菌毛与受体菌细胞直接接触，遗传物质自供体菌转移入受体菌（原核微生物遗传物质转移方式，较广泛）。二、接合（conjugation）（一）接合现象1946年，J.Lederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验。很幸运，他们选择了大肠杆菌K12，选择了位于染色体同一个区域的遗传标记。当前第107页\共有141页\编于星期四\19点当前第108页\共有141页\编于星期四\19点当前第109页\共有141页\编于星期四\19点当前第110页\共有141页\编于星期四\19点①回复突变；②转化的结果；③互养，即营养缺陷型菌株相互交换营养而均得到生长；④形成了异核体即细胞融合后，两种染色体共存在一个细菌细胞中。“U”型管实验可以解释为细菌之间接合后发生的遗传交换和重组，但必须排出以下几种可能：当前第111页\共有141页\编于星期四\19点当前第112页\共有141页\编于星期四\19点当前第113页\共有141页\编于星期四\19点F因子（F质粒/致育因子）（1）性状—凡F+菌株，有1-4根性菌毛；（2）特点—F因子可游离于细胞内，也可插入或整合到染色体上；（3）F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。当前第114页\共有141页\编于星期四\19点F因子的四种细胞形式根据细胞中是否存在F因子以及其存在方式的不同，把E.coli分成四种结合型的菌株。①F－菌株：不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；②F＋菌株：F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。③Hfr（高频重组）菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。④F′菌株：Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。当前第115页\共有141页\编于星期四\19点当前第116页\共有141页\编于星期四\19点接合机制性菌毛使F+、F-菌株细胞靠近，接触，形成聚集体；F因子的一条DNA链在特定位点断裂；断裂后单链逐步解开，5’端延伸入F-细胞，复制成环状双链DNA；

供体菌内环状DNA单链进行“滚环复制”成双链。当前第117页\共有141页\编于星期四\19点1、F＋×F－杂交杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F＋细胞，即：F＋×F－＝F＋＋F＋F＋菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。当前第118页\共有141页\编于星期四\19点当前第119页\共有141页\编于星期四\19点Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2、Hfr×F－杂交Hfr菌株仍然保持着F＋细胞的特征，具有性菌毛，并象F＋一样与F－细胞进行接合。所不同的是，F因子的先导区（leadingregion）结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F－杂交后的受体细胞（或接合子）大多数仍然是F－。当前第120页\共有141页\编于星期四\19点当前第121页\共有141页\编于星期四\19点当前第122页\共有141页\编于星期四\19点携带F′因子的菌株称初生F′菌株（primaryF′strain）。

F′×F－与F＋×F－的不同：供体菌的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞。①与染色体发生重组；②继续存在于F′因子上，形成部分二倍体（次生F′菌株）；

细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。3、F′×F－杂交当前第123页\共有141页\编于星期四\19点当前第124页\共有141页\编于星期四\19点三、转导（transduction）

通过完全或部分缺陷噬菌体为媒介，将供体菌的DNA片段携带到受体细胞，通过交换与整合，从而使受体菌获得供体菌的部分遗传性状。细菌转导的类型普遍转导局限转导完全转导流产转导高频转导低频转导当前第125页\共有141页\编于星期四\19点当前第126页\共有141页\编于星期四\19点吸附供体菌

侵染

装配(误包)裂解释放，侵染新宿主菌受体菌

复制当前第127页\共有141页\编于星期四\19点完全转导完全缺陷噬菌体将DNA小片段从供体菌转移到受体菌

媒介—烈性或温和噬菌体

过程供体菌遗传物质→（媒介）→受体菌→转导子当前第128页\共有141页\编于星期四\19点完全普遍转导的过程误包完全缺陷噬菌体当前第129页\共有141页\编于星期四\19点流产转导（1）由噬菌体带入的供体菌基因不交换，不整合，不复