第三章基因克隆的载体

第三章基因克隆的载体第一页，共三十页，编辑于2023年，星期一第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）第二页，共三十页，编辑于2023年，星期一引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽。自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。第三页，共三十页，编辑于2023年，星期一载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第四页，共三十页，编辑于2023年，星期一载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点第五页，共三十页，编辑于2023年，星期一CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene第六页，共三十页，编辑于2023年，星期一第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）第七页，共三十页，编辑于2023年，星期一第一节质粒载体（plasimidvectors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍第八页，共三十页，编辑于2023年，星期一1.质粒载体的生物学特性（1）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。第九页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒：是一种裸露的双链闭环DNA分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。第十页，共三十页，编辑于2023年，星期一多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。第十一页，共三十页，编辑于2023年，星期一1.质粒载体的生物学特性（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到

200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。第十二页，共三十页，编辑于2023年，星期一1.质粒载体的生物学特性（4）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）第十三页，共三十页，编辑于2023年，星期一1.质粒载体的生物学特性（5）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigentplasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。（6）质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。第十四页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒的不相容性

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容第十五页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒的不相容性分子机制：两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势第十六页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定第十七页，共三十页，编辑于2023年，星期一携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义第十八页，共三十页，编辑于2023年，星期一第一节质粒载体（plasimidvectors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍第十九页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101:8.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TetrColE1:6.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1PSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr第二十页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒:突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因低拷贝质粒:来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒:在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒:含有测序通用引物互补序列和多酶接polylinker整合质粒:装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒:装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒:装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒:装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选第二十一页，共三十页，编辑于2023年，星期一重要的大肠杆菌质粒载体pBR322：松弛型复制氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆:pMB1Ampr:PSF2124Tetr:pSC101第二十二页，共三十页，编辑于2023年，星期一pBR3224363连接加反应液TetorAmpTet+AmpCK+2.质粒载体相关知识介绍第二十三页，共三十页，编辑于2023年，星期一重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于基因克隆和测序

第二十四页，共三十页，编辑于2023年，星期一β-半乳糖苷酶的a-肽段a重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’

的显色原理MCSlacZ’PlacpUC18/19IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)

X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚基-β

-D-半乳糖苷5-溴-4-氯靛蓝第二十五页，共三十页，编辑于2023年，星期一（1）-互补

(alpha-complementation)

大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ

基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ

基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是alpha-complementation.2.质粒载体相关知识介绍第二十六页，共三十页，编辑于2023年，星期一

所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。2.质粒载体相关知识介绍第二十七页，共三十页，编辑于2023年，星期一重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等pGEM-3E2743bpAprorilacZ’PT7MCSPSP6第二十八页，共三十页，编辑于2023年，星期一质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法:质粒DNA纯度高、周