生物工程下游技术微生物细胞破碎

生物工程下游技术微生物细胞破碎第一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日酶来源应用范围L-天冬酰氨酶EruiniaCaratovoraEscherichiaColi治疗急性淋巴癌过氧化氢酶Aspergillusniger牛奶灭菌后H2O2的清除胆固醇氧化酶Nocardiahodochrous胆固醇浆液分析β-半乳糖苷酶KluyveromycesfragilisSaccharomyceslactis在牛奶/乳清中乳糖的水解作用葡萄糖氧化酶AspergillusnigerPenicilluimnotatum葡萄糖浆液分析食品中氧的清除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Yeast临床分析蔗糖酶SaccharomycesCerevisiae糖果、蜜饯青霉素酰化酶EscherichiaColi苄青霉素的脱酰作用表1胞内酶举例细胞破碎的必要性第二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日药物名宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤表2几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物第三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日细胞壁的组成与结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20~8010~13100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40％～90％）、多糖、胞壁酸、蛋白质、脂多糖（1％～4％）肽聚糖（5％～10％）脂蛋白、脂多糖（11％～22％）磷脂、蛋白质葡聚糖（30％～40％）甘露聚糖（30％）、蛋白质（6％～8％）、脂类（8.5％～13.5）多聚糖（80％～90％）脂类、蛋白质第四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

图1革兰氏菌细胞壁结构图（a）革兰氏阳性菌（b）革兰氏阴性菌第五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

图2酵母细胞壁的结构示意图M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖第六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。内因：连接细胞壁网状结构的共价键。外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等。第七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日破碎程度的评价

破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：

Y（%）=[（N0-N）/N0]*100

其中N0——原始细胞数量；

N——经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。第八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日N0和N的确定方法：直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。第九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日细胞破碎技术第十页，共四十三页，编辑于2023年，星期日其他新的细胞破碎方法：

激光破碎法冷冻-喷射法高速相向流撞击法第十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日细胞声波搅拌液压冷冻压力动物细胞7777革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌6566革兰氏阳性芽孢杆菌5(4)54酵母3.5342.5革兰氏阳性球菌3.5(2)32.5孢子2(1)21菌丝16(1)5表3细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。第十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日常用的破壁方法珠磨法高压匀浆法超声波破碎法X-press法机械法非机械法酶溶法化学渗透法渗透压法冻结融化法干燥法第十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日常用的破壁方法——珠磨法作用机理：固体剪切作用图3水平搅拌式珠麿机结构示意图1—细胞悬浮液2—细胞匀浆液3—珠液分离器4—冷却液出口5—搅拌电机6—冷却液进口7—搅拌桨8——玻璃珠第十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日第十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

破碎作用遵循一级动力学定律：

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破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。第十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm较好，工业规模不得小于0.4mm。不同的细胞类别及所需提取的酶在细胞中的位置等也是应考虑的因素。第十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

有研究表明，减小磨珠直径起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。

eg.从酵母细胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如1mm直径）磨珠。第十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

在一定范围内，增加珠体装填量可以提高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-90%，并随珠体大小变化。第二十页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用NetzschLM20研磨机破碎时，细胞浓度控制在40%左右。第二十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日Currie等人的研究表明，操作温度控制在5-400C范围内对破碎物的影响较小。常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨室的温度。第二十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日作用机理：液体剪切作用常用的破壁方法——高压匀浆图5高压匀浆机装置图第二十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日第二十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日第二十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

此方法中影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由500C提高到300C，破碎率约提高1.5倍。

第二十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日图7细胞浓度及压力大小对破碎率的影响匀浆次数图8匀浆次数对破碎效果的影响第二十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日常用的破壁方法——超声波破碎作用机理：空化现象

由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲击波的现象。第二十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

超声波振动在液体中传播的音波压强达到1atm时，功率密度为0.35w/cm2，这时超声波的音波压强峰值可达真空或负压，但实际上无负压存在，因此在液体中产生一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非常接近真空，在超声波压强反向达到最大时破裂。

第二十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日图10USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机图9超声波细胞破碎仪的结构示意图第三十页，共四十三页，编辑于2023年，星期日振幅细胞悬浮液的黏度表面张力被处理悬浮液的体积珠粒的体积和直径探头的形状和材料细胞悬浮液的流速影响参数第三十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

常用酶：溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等。常用的破壁方法——酶溶法

作用机理：

利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。第三十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日eg.蜗牛酶——从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种。第三十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

在某些情况下，不加外源酶也可使某些微生物发生自溶。

eg.谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌）加入pH10的缓冲液（0.028mol/LNa2CO3—0.018mol/LNaHCO3

），配3%的细胞悬浮液，加热至700C，保温搅拌20min，菌体即自溶。

第三十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

所用的化学试剂：酸、碱、表面活性剂、脂溶性有机溶剂、EDTA鳌合剂、变性剂等。常用的破壁方法——化学渗透法

作用机理：改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。第三十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日酸、碱：用来调节溶液的pH值，改变细胞所处环境，改变蛋白质的电荷性。有机溶剂：常用的是甲苯，被细胞壁脂质层吸收后导致胞壁膨胀，造成细胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。第三十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日表面活性剂：天然的如胆酸盐、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。变性剂：如盐酸胍，与水中氢键作用，消弱溶质分子间的疏水作用。第三十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日eg.1.某些动物细胞（肿瘤细胞）可采用SDS、去氧胆酸钠等破坏细胞膜；而细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果较好。

2.用Triton从一种诺卡氏菌中选择性地提取胆固醇氧化酶。第三十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

温和化学渗透剂

温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量较小的非极性Ｒ基氨基酸。其破碎机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙氨酸更易渗透到细胞壁中,通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构,从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。第三十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日细胞类别变性剂清洁剂有机溶剂酶抗生素生物试剂鳌和剂革兰氏阴性菌****